基于生物信息技術分析人參皂苷防治乳腺癌的作用機制

吳勤研,藍曉紅,吳 波,魏 瑋,李薛梅,初曉玲,高 茗

0 引 言

乳腺癌是女性患者最常見的一種惡性腫瘤，國際的發病率在11%左右，而我國的乳腺癌發病率占女性患者的16%左右，在女性患者惡性腫瘤發病率占第一位，其發病率、致死率高，嚴重威脅女性健康[1-2]。乳腺癌的發病風險是隨著年齡增大而升高，但隨著生活環境、作息習慣的改變，生活壓力聚增，乳腺癌的發病年齡逐漸呈年輕化的趨勢。現階段治療乳腺癌的方法有手術、化療、放療、內分泌治療、靶向藥物治療和抗體藥物偶聯劑治療等，但伴隨惡心、嘔吐、骨髓抑制、心血管系統障礙和耐藥性增加等諸多不良反應[3]。中藥屬于天然藥物，相比合成藥物而言，刺激性和毒副作用小，不少研究學者提出中醫藥充當輔助用藥[4]。人參是我國古老的中藥材之一，具有補氣生津、扶正祛邪、補脾益肺和安神益智等功效[5-6]。現代藥理研究表明人參可以增強記憶力[7],提高免疫力[8]，抗衰老[9]和抗腫瘤[10-11]等藥理作用。人參皂苷是人參的主要藥效成分，由糖和苷元連接而成，常見的單體皂苷有Rg1、Rb1、Rc、Re、Rd、Rf和Rg1等等。現有文獻報道了單一皂苷抗腫瘤效果，尚不能反映整體效果和毒副作用。筆者依托生物信息技術，比較人參皂苷組與空白對照組，獲取差異表達基因，分析基因功能與代謝通路的作用機制，闡釋人參皂苷防治乳腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料所用平臺：基因表達數據庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質相互作用數據庫STRING(https://string-db.org/)，用于注釋、可視化和集成發現的數據庫DAVID 6.8(http//david-d.ncifcrf. gov/tools. jsp)；軟件：生物醫學數據分析盒子SangerBox(http://vip. sangerbox.com/home.html)，可視化分析軟件Cytoscape 3.7(https://cytoscape.org/)，圖像處理軟件GraphPad Prism 8(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片獲取與差異基因的篩選在GEO數據庫輸入GS85871，得到關于人乳腺癌細胞MCF7的芯片信息(分析平臺為GPL571)。先將樣本進行分組：“Treatment”為人參皂苷(Rg1、Rb1、Rb3、Rc、Rb2、Re和Rd)干預組，“Control”為空白對照組。然后運用在線分析工具GEO2R對20個樣本進行分析(其中人參皂苷干預組有14個樣本，空白對照組有6個樣本)，并設置篩選條件(P<0.05,∣log2FC∣≥1)[12-14]。

1.2.2 蛋白互作PPI網絡分析將篩選后的差異基因導入到STRING平臺，設置種族為“Homo sapiens”，最低工作閾值為0.4，其他參數默認[15]，提交。將所得結果導入Cytoscape 3.7軟件，用“Network analyzer”工具對結果進行分析，按度值(Degree)進行排序，得到核心基因(篩選條件Degree≥5)。

1.2.3 基因本體(GO)和京都基因百科全書KEGG通路富集將差異基因導入DAVID 6.8平臺，種族設置為“Homo sapiens”，選擇標識符設置為“Offical gene symbol”，得到基因本體(GO)功能富集和KEGG信號通路富集分析數據。

2 結 果

2.1 差異基因的篩選與分析將人參皂苷干預組與空白對照組組進行比較，得到182個差異基因，其中上調有110個，下調有72個。運用SangerBox繪制火山圖，見圖1；利用GraphPad Prism 8軟件繪制前30個上調基因或下調基因的熱圖，見圖2。

綠色點表示下調基因，紅色點表示上調基因，點距離中線越遠，差異倍數越大

藍色方塊表示下調，黃色方塊表示上調

2.2 基因本體(GO)功能富集分析分別將上調和下調差異表達基因導入到DAVID 6.8平臺，進行GO富集分析。上調基因富集在細胞外間隙、軸突、突觸后膜和質膜外側，主要參與細胞黏附、蛋白質磷酸化的正調控、軸突導向、對缺氧的反應和膠質細胞遷移等生物過程，見表1。下調基因顯著富集在胞外區、蛋白質細胞外基質、細胞外間隙、內質網腔和質膜，主要參與對 cAMP 的反應、內皮細胞遷移的正調控、血小板脫粒、細胞間信號轉導、細胞黏附、細胞表面受體信號通路和血管生成的負調控等生物過程，見表2。

表1 上調基因的GO功能注釋(涉及生物學過程、分子功能和細胞組成)

表2 下調基因的GO功能注釋(涉及生物學過程、分子功能和細胞組成)

2.3 京都基因百科全書KEGG通路富集上調基因富集主要在甲狀旁腺激素合成、分泌和作用(hsa04928)、GnRH 分泌(hsa04929)、阿米巴病(hsa05146)和多巴胺能突觸(hsa04728)。下調基因富集主要在細胞因子-細胞因子受體相互作用(hsa04060)、PI3K-Akt 信號通路(hsa04151)和ECM-受體相互作用(hsa04512)等。差異表達基因富集主要在細胞因子-細胞因子受體相互作用(hsa04060)、阿米巴病(hsa05146)、弓形體病(hsa05145)、癌癥中的微小RNA(hsa05206)、ECM-受體相互作用(hsa04512)、2型糖尿病(hsa04930)和瘧疾(hsa05144)。見圖3。

a:上調基因通路富集;b:下調基因通路富集;c:差異表達基因通路富集

2.4 差異表達基因蛋白互作PPI分析將差異表達基因導入STRING平臺，設置相應參數，得到蛋白互作PPI網絡，見圖4，圖中有169個節點(無效基因有13個)，184條邊，平均節點度值為2.18，PPI富集校正值為2.56×10-8；然后將數據導入Cytoscape 3.7軟件，計算拓撲網路的度值，并按度值進行排序，設置篩選條件，得到9個核心基因，分別是VEGFA,BMP4,SPARC,PLG,ITGB2,TEK,SERP,INA1,SERPINB5和IGFBP7,對核心基因進行蛋白互作PPI網絡，見圖5，圖中有9個節點，19條邊，平均度值4.22，PPI富集校正值為2.59×10-11。

圖4 差異基因PPI網絡圖

圖5 核心基因PPI網絡圖

3 討 論

中醫理論認為“正氣存內，邪不可干”、“邪不能獨傷人”，正氣虛弱是腫瘤發病的主要因素，體內正氣不足時出現外邪侵體，損傷人體臟腑氣血，長年累月則發病，因此扶正祛邪是中醫藥治療乳腺癌的關鍵所在[16]。現代中醫運用人參、熟地、白術、茯苓以益氣健脾，可通過增強淋巴細胞增殖、增強機體免疫功能，同時誘導細胞凋亡來抑制腫瘤發展。大量研究報道人參皂苷抑制乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡，被廣泛運用于抗乳腺癌的輔助用藥中，但其生物學作用機制尚不清楚[17-19]。生物信息技術作為現代科學技術發展的產物，融合了基因組學、蛋白質組學、免疫組學、代謝組學等多組學的數據集，利用微陣列、高通量測序工具，從基因、蛋白質序列出發，分析相關的生物信息，并通過大數據篩選出與腫瘤發生、發展和預后密切相關的基因，通過對目標基因的分析，可以預測藥物的作用機制及可能引起的不良反應[20-21]。筆者采用生物信息學的技術方法從GEO數據庫中挖掘人參皂苷作用于乳腺癌的基因芯片(GSE85871)。通過比較人參皂苷干預組與乳腺癌細胞組(MCF3/Adr)，得到人參皂苷調控乳腺癌的差異表達基因有182個(其中上調有110個，下調有72個)。在此基礎上，運用STRING平臺構建差異表達基因蛋白互作PPI網絡，并運用David6.8平臺進行GO和KEGG通路富集分析。

PPI網絡分析得到核心基因VEGFA,PLG,SPARC,BMP4,TEK,SERPINA1,SERPINB5,ITGB2和IGFBP7，其中VEGFA,PLG和SPARC在網絡中的分值較高，在疾病的發生、發展過程中起著關鍵作用。血管內皮生長因子A(vascularendothelial growth factor A，VEGFA)屬于VEGF家族成員中的一員，在調控血管生成網絡中起重要著作用[22]。正常組織受到外界創傷以及女性生理月經周期，血管生成通路將會被激活，進而形成新血管[23]。腫瘤組織中VEGFA過度表達，形成新生血管量高于正常組織，影響周圍正常組織細胞生理代謝[24]。纖溶酶原(plsmingen, PLG)是血漿纖維蛋白水解酶的無活性前體，屬于絲氨酸蛋白酶，被組織激活物t-PA、尿激酶或凝血接觸階段多種酶激活，轉變成纖溶酶溶解纖維蛋白。進一步研究發現纖溶酶能促進細胞遷移，參與了乳腺癌細胞的侵襲和轉移[25-26]。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(cysteine-rich acidic secreted protein, SPARC)是一種小分子酸性糖蛋白，廣泛分布在生物體內，參與組織重建、形態生成、細胞遷移和增殖，與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關[27-28]。與對照組比較，人參皂苷干預后乳腺癌細胞的VEGFA、PLG和SPARC表達降低，推測人參皂苷作用于上述靶點基因抑制乳腺癌細胞增殖、黏附、侵襲和轉移。

GO生物過程涉及細胞黏附、發芽血管生成、細胞遷移與癌細胞的生長繁殖密切相關。KEGG結果發現12條信號通路，主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、阿米巴病信號通路、弓形蟲病信號通路、癌癥中的微小RNA信號通路和ECM-受體相互作用信號通路等，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥中的微小RNA和ECM-受體相互作用信號通路與癌細胞的增殖、分化、轉移有著密切聯系。細胞因子是由免疫原或其他因子刺激細胞產生，具有調節細胞的生長和分化、調節免疫、參與炎癥發生和創傷愈合等功能的小分子多肽的總稱。細胞因子通過結合細胞表面相應的細胞因子受體而發揮生物學作用。細胞因子和其受體的結合是細胞因子介導的細胞信號轉導的啟動刺激。大多數細胞因子對乳腺癌細胞具有抑制生長、促進凋亡的負面作用，同時具有促進生長繁殖、為侵襲轉移提供條件的作用。微小RNA(又稱miRNA)是一類小分子非編碼RNA，在乳腺癌中可扮演癌基因或抑癌基因，在腫瘤侵襲轉移級聯反應各個階段起到促進或抑制作用，與腫瘤的上皮-間質轉化及腫瘤干細胞的生存高度相關[29]，miRNA作為乳腺癌早期診斷的標識物在臨床上被廣泛運用。細胞外基質(extracellular matrix, ECM) 是腫瘤微環境的重要組成部分，由支持細胞和組織架構的蛋白質、糖蛋白和多糖組成的復雜混合物，與特定細胞表面受體結合，激活信號轉導級聯反應等途徑促進多種惡性腫瘤細胞的生長、增殖、轉移和耐藥性的形成。此外，ECM蛋白降解過程中釋放調節多種細胞活性的肽類分子(統稱細胞外基質活性素matrikine)，調節腫瘤細胞活性和血管生成，并參與腫瘤分化、浸潤和侵襲過程。以上研究表明人參皂苷主要通過抑制腫瘤細胞增殖、轉移、生長及血管形成途徑來防治乳腺癌。

綜上所述，人參皂苷通過對多個基因、多個靶點和多條信號通路來抑制乳腺癌細胞增殖、分化和侵襲。本文選取的人參皂苷單體成分較為局限，不能完全反映人參抗癌物質成分。此外，現有文獻報道人參多糖對癌細胞的增殖有顯著的抑制作用。因而，抗癌活性成分篩選及相關機制仍需深入研究。