基于CRISPR/Cas9系統高效編輯小鼠miR let-7a

周 嵐，張生貴，胡祖梁，王添賢， 岳鵬鵬，于鴻浩*

(1.桂林醫學院 生物技術學院 細胞與遺傳學教研室，廣西 桂林 541104；2.桂林醫學院第二附屬醫院 放射科， 廣西 桂林 541199)

miRNAs是一類內源性的非編碼RNA，長約20～25個核苷酸，可以對基因表達轉錄后過程進行調控。它們通過堿基互補結合靶基因的3′非翻譯區(3′untranslated regions,UTRs)發揮重要的調節作用，導致mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，從而調控基因表達[1-2]。let-7家族作為最早被發現的miRNAs之一，在人體發育、細胞分化、增殖和凋亡等多個生物學現象中發揮著重要的調節作用。let-7a是let-7家族中重要的成員，let-7a作為一種抑癌基因在乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肺癌[5]、鼻咽癌[6]以及口腔鱗癌[7]中表達顯著下調，并且在乳腺癌和肺癌中，患者的生存時間與let-7a的表達水平呈正相關。由此可見，let-7a在多種腫瘤的發生過程中發揮重要的作用，是一種關鍵的腫瘤發生調控 miR，但其功能異常在腫瘤的發生和發展中的作用機制仍需進一步闡明，本研究為后續探討let-7a基因突變對腫瘤發生和發展的作用提供了基礎，同時也為治療癌和let-7a作為腫瘤預后標志物提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠N2a細胞、sgRNA表達質粒、Cas9表達質粒(上海科技大學黃行許教授惠贈)，大腸桿菌DH5α菌株感受態細胞、無內毒素質粒中提試劑盒(康為世紀公司)，BsaⅠ限制性內切酶(NEB公司)。InvitrogenTMLipofectamineTM3000轉染試劑、胎牛血清、DMEM高糖培養基、殺稻瘟霉素和嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific 公司)。TransDirect? Animal Tissue PCR Kit試劑、Trans2K? Plus DNA Marker、EasyTaq? DNA Polymerase試劑(北京全式金生物技術有限公司)，pMDTM19-T Vector Cloning Kit試劑(寶日醫生物技術有限公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)。序列合成和測序均由廣州擎科生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 構建PGL3-sgRNA的重組質粒：雖然人和小鼠兩個物種let-7a的成員組成及染色體定位上有所不同，但脊椎動物中let-7a家族成員的序列高度保守，表明不同物種中let-7a的功能也是保守的。

小鼠let-7a的編碼位點有兩個,分別是let-7a-1和let-7a-2，位于13號染色體和9號染色體。利用miRNAmap(http://mirnamap.mbc.nctu. edu.tw/index.php)和Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html)在線數據庫，分析let-7a-1和let-7a-2的編碼序列。根據sgRNA設計原則利用軟件Vector NTI 11.5針對let-7a-1和let-7a-2各設計兩對dual-sgRNAs。分別為let-7a-1-M-sg1、let-7a-1-M-sg2、let-7a-1-M-sg3和let-7a-1-M-sg4；let-7a-2-M-sg1、let-7a-2-M-sg2、let-7a-2-M-sg3和let-7a-2-M-sg4。根據上述打靶位點，在合成特異靶向小鼠let-7a基因的 sgRNA 導向序列的 5′ 端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列，在反義鏈的 5′ 端添加黏性末端aaac。將合成的Oligo序列進行退火反應，形成雙鏈 DNA片段。將sgRNA雙鏈DNA片段與pGL3-U6-sgRNA-BsaⅠ連接，測序驗證正確后，提取獲得上述所需pGL3-U6-let-7a-sgRNA質粒，詳細步驟參考已發表文章[8]。

1.2.2 細胞轉染及藥物篩選：將小鼠神經瘤母細胞(N2a)培養于DMEM完全培養基(添加10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2濃度，飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每周更換培養基2～3次，待其增殖至細胞匯合度達到80%～90%后，胰蛋白酶消化，傳代種板至6孔板中，繼續培養16～18 h后，待6孔板中細胞匯合度達到80%～90%時，進行轉染。采用InvitrogenTMLipfectamineTM3000試劑盒共轉染pGL3-U6-let-7a-sgRNA表達質粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達質粒，其中每孔轉染pGL3-U6-let-7a-1-sgRNA1(1.25 μg)、pGL3-U6-let-7a-1-sgRNA2(1.25 μg)、pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(2.5 μg)。留兩孔不轉染作為空白對照，轉染時基底液均為opti-MEN培養液，轉染 6 h 后用 PBS緩沖液清洗，換為DMEM完全培養基(添加10%胎牛血清)繼續培養，培養24 h后換液，并加入 12 μg/mL的嘌呤霉素和 110 μg/mL的殺稻瘟菌素進行藥物篩選，直至對照組細胞大部分被藥物殺死且轉染孔細胞仍大量存活時收取細胞，以獲得陽性的共轉染N2a細胞。

1.2.3 陽性細胞基因組DNA提取及打靶位點的PCR 擴增產物測序：分別以上述4對dual-sgRNAs、Cas9質粒共轉染陽性細胞的細胞裂解液為模板，進行打靶位點DNA片段的PCR擴增反應，PCR擴增體系為:模板 2 μL，dNTPs 2 μL，A+S(上下游引物) 2 μL，Easy Taq?DNA Polymerase 0.5 μL，10x Easy Taq?緩沖液2.5 μL,補充滅菌水至25 μL。其中let-7a-1引物的退火溫度為60.9 ℃，let-7a-2引物的退火溫度為56.8 ℃。引物序列見表1。對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至擎科生物公司進行Sanger法測序驗證。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.4 TA克隆測序分析：對測序結果顯示初步發生基因編輯的PCR產物進行回收純化、重組DNA構建(連接)、轉化和篩選獲得目的基因，連接的反應體系為：pMD19-T質粒載體0.5 μL，連接液solution Ⅰ 2.5 μL，PCR純化產物2 μL，16 ℃金屬浴1 h。取5 μL連接產物轉化至感受態大腸桿菌中，經過氨芐青霉素篩選得到陽性菌落，將菌液均勻涂布至LB固體培養基上，37 ℃恒溫箱中過夜培養20 h后，挑取單克隆菌落，進行菌落PCR反應，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，挑選陽性克隆菌落送測，測序結果與野生型序列比對分析，進一步進行基因分型。

2 結果

2.1 sgRNA設計及PGL3-sgRNA重組質粒構建

設計的4對dual-sgRNAs導向序列(表2)在let-7a上的靶序列符合 5′-N(21)GG排列規則，并且在let-7a上的靶序列是唯一的。按照上述方法所構建的pGL3-U6-let-7a-sgRNA質粒電泳圖(圖1)，質粒大小與預期相符。表明sgRNA的表達載體成功。

表2 化學合成的sgRNA序列Table 2 Chemosynthetic sgRNA sequences

M.DL5000 DNA marker; 1.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA1 plasmid;2.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA2 plasmid;3.pGL3- U6-let-7a-1-M-sgRNA3 plasmid; 4.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA4 plasmid; 5.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA1 plasmid; 6.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA2 plasmid; 7.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA3 plasmid; 8.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA4 plasmid圖1 let-7a表達質粒電泳圖Fig 1 Electrophoretic image of let-7a expression plasmid

2.2 藥物篩選得到sgRNA-Cas9的陽性共轉染細胞

小鼠N2a細胞共轉染pGL3-U6-let-7a-sgRNA表達質粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達質粒，經過嘌呤霉素和殺稻瘟菌素藥物篩選52 h后，可見對照組細胞基本死亡，轉染組細胞仍大量存活(圖2)。此時收取細胞進行打靶位點PCR擴增實驗及測序分析。

2.3 打靶位點PCR擴增及產物測序

打靶位點PCR產物電泳結果(圖3)，目標條帶與用 SnapGene軟件計算出來的分子質量大小基本一致，target-1 為658 bp，target-2 為562 bp，擴增條帶清晰，擴增效率較高，對PCR產物進行測序，測序結果見圖4，測序結果發現在兩個靶點位置均有套峰出現，說明靶點位置存在不同的DNA序列，初步表明發生了基因編輯打靶成功。

the two control groups’ cells were treated with the same method as blank control of let-7a-1 and let-7a-2 targeting sites respectively; the remaining four groups’s cells were con-transfected with corresponding pGL3-U6-let-7a-sgRNA and pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 expression plasmids respectively

M.DL5000 DNA marker; 1.let-7a-1 control group cells; 2.let-7a-1-sg1,2-Cas9 contransfection cells; 3.let-7a-1-sg3,4-Cas9 contransfection cells; 4.let-7a-2 control group cells; 5.let-7a-2-sg1,2-Cas9 contransfection cells; 6.let-7a-2-sg3,4-Cas9 contransfection cells圖3 打靶位點PCR擴增電泳圖Fig 3 PCR amplification electrophoretic image of target sites

2.4 TA克隆測序結果及打靶效率分析

4個位點分別送測19、 16、 19、 19個菌落克隆，利用通用引物M13F進行測序。測序結果與野生型序列對比分析(圖5～6)，在4對 sgRNA 導向序列發生了堿基的隨機插入、缺失、替換等突變，編輯效率分別為42.10%、62.50%、52.63%、47.37%。表明本研究所設計的sgRNA均可以介導 Cas9 蛋白，能有效、特異性的切割靶點 DNA序列。

3 討論

CRISPR/Cas9 系統作用于真核細胞內基因后，細胞內會產生非同源末端連接(NHEJ)或者同源性定向修復(HDR)兩種修復途徑[9]。本實驗利用NHEJ修復途徑直接將斷裂的DNA雙鏈連接，但此修復方式會造成堿基的缺失，破壞基因開放閱讀框，使目的基因發生移碼或無義突變， 導致基因失活，從而實現基因敲除的目的[10]。為了進一步提高let-7a基因敲除(KO)效率，探索在靶部位精確編輯DNA的可行性[11]，本實驗創新性的針對小鼠 miR分子let-7a的兩個編碼位點let-7a-1和let-7a-2各設計了兩對dual-sgRNAs，所導向的靶標序列均發生了突變，突變類型以堿基缺失為主。得到了較高的打靶效率。

A.blue background represents let-7a-1-sg1,2 targeting sites; B.blue background represents let-7a-1-sg3,4 targeting sites; C.blue background represents let-7a-2-sg1,2 targeting sites; D.blue background represents let-7a-2-sg3,4 targeting sites

The red fonts are the targeting sequence, the green fonts are PAM structure, and the lowercase letters are mutant bases. “……” represents the unlisted base sequences.“-” indicates base deletions. “+” indicates base insertions. “→” indicates base substitutions. “# N” indicates the sequences number. “N/ N” indicates the proportion of the genotype in the number of TA clone sequences

The red fonts are the targeting sequence, the green fonts are PAM structure, and the lowercase letters are mutant bases. “……” represents the unlisted base sequences.“-” indicates base deletions. “+” indicates base insertions. “→” indicates base substitutions. “# N” indicates the sequences number. “N/ N” indicates the proportion of the genotype in the number of TA clone sequences

越來越多的研究證實，miR表達失調會導致進行性和失控的腫瘤生長。根據靶基因的特定功能，miRNAs既可以是腫瘤抑制基因， 也可以是通過作用于靶基因的促癌基因。在腫瘤細胞中，高表達的miRlet-7a可以顯著抑制細胞增殖、侵襲、體內成瘤及轉移[12]。根據現有文獻報道，let-7a主要通過調控下游靶基因發揮抑癌功能，下游靶基因主要有K-RAS、HMGA2、EZH2、c-Myc等[13-14]，但目前miRlet-7a發揮腫瘤抑制作用的機制尚未完全闡明。本研究通過CRISPR/Csa9 技術在細胞層面對let-7a進行敲除， 為后續建立let-7a敲除小鼠模型，在個體水平上探討let-7a基因功能缺失對腫瘤發生的作用打下基礎。同時let-7a靶點的深入挖掘和作用機制的闡明對多種腫瘤的診斷、預測及治療具有重要的理論指導意義。