小鼠乳腺癌干細胞免疫相關分子表達和免疫浸潤的分析

李昱陽，李釗璇，羅云萍，陳 翀

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 免疫學系, 北京 100005)

腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)也稱為腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells，TICs)，是一小群具有自我更新能力和分化潛能的腫瘤細胞亞群[1]，并且已在多種類型的惡性腫瘤中鑒定并分離出來[2-6]。腫瘤干細胞是腫瘤起始、復發和轉移的根本原因[7]，也是目前腫瘤基礎與臨床研究的熱點問題。

基因突變產生的抗原可以遞呈到腫瘤細胞表面，從而被機體的免疫細胞所識別和清除。然而，腫瘤細胞可以通過下調抗原加工與遞呈的分子通路來躲避機體免疫細胞的攻擊，并最終形成惡性腫瘤[8-10]。另外，許多研究已經證實，腫瘤細胞可以上調具有免疫抑制作用的檢查點分子來抵抗免疫細胞的殺傷[11]。在臨床中，靶向免疫檢查點的治療讓許多晚期的腫瘤患者從中獲益，革命性地改變了腫瘤免疫治療現狀[12]。然而，關于腫瘤干細胞免疫原性和免疫逃逸的研究鮮有報道，腫瘤干細胞在抵抗免疫治療中的作用也不清楚。

為了探討腫瘤干細胞與機體免疫防御系統的相互關系，本研究較為全面地分析了小鼠乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells, BCSCs)中免疫檢查點與抗原遞呈相關分子的表達情況，然后利用小鼠移植瘤模型在體內研究乳腺癌干細胞成瘤后的免疫浸潤特點，從而初步探討了小鼠乳腺癌干細胞免疫原性和免疫逃逸相關的表型特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：小鼠乳腺癌細胞系 4T1 和 4T07 (ATCC)。

1.1.2 動物：SPF 級 6～8 周齡，Balb/c 雌鼠(中國醫學科學院基礎醫學研究所實驗動物中心)。

1.1.3 試劑：RPMI 1640(Biological Industries 公司)；低吸附10 cm培養皿(Corning公司)；胎牛血清、100×青霉素鏈霉素(Gibco公司)；成球培養基(Stem Cell公司)；RT-qPCR試劑盒和 qPCR試劑盒(南京諾唯贊公司)；流式抗體：CD45-Percp、CD3-FITC、CD4-APC、CD8-APC、CD11b-APC、CD11c-APC和MHC2-FITC(Biolegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的成球培養：將處于對數增殖期的腫瘤細胞消化成單個細胞，用無血清的成球培養基重懸，對其進行細胞計數，并將細胞濃度調整為 1×103個/mL，在 37 ℃，5% CO2的孵箱中培養 7 d后用 70 μm的細胞篩收集腫瘤細胞球。

1.2.2 RT-qPCR檢測免疫相關基因的mRNA：將所得到的貼壁細胞和細胞球分別用Trizol試劑收集，室溫裂解后加入三氯甲烷迅速混勻，在 4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，收集上清液并加入等體積的異丙醇顛倒混勻，室溫靜置 10 min，在 4 ℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清，用75%乙醇溶液洗滌兩次棄掉上清，室溫晾干沉淀，加入無RNase的無菌水溶解沉淀。按說明書操作將1 μg的 RNA反轉錄得到cDNA。以GAPDH為內參，利用SYRB Green法按說明書進行real-time PCR檢測，并且分析基因在RNA水平的相對表達量。

1.2.3 蛋白質免疫印跡檢測干性相關蛋白：提取總蛋白質測定濃度后進行 SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量為 35 μg，恒流電泳 2 h。用濕轉法轉膜至 PVDF 膜，封閉后分別孵育一抗 SOX2、OCT4和β-actin過夜，次日洗膜3次后孵育二抗1 h，再次洗膜后滴加顯影液，拍攝條帶并用ImagJ軟件進行吸光度掃描分析。

1.2.4 4T1 乳腺癌移植瘤模型的建立：將 8周齡的Balb/c雌鼠隨機分成兩組，每組6只。將成球培養 7 d后且直徑大于 70 μm的細胞球以及處于對數增殖期的4T1貼壁細胞消化成單個細胞，分別用PBS重懸成 5×105個/mL，并接種 100 μL于小鼠右側的第四乳腺脂肪墊中。

1.2.5 流式細胞測量術檢測各種免疫細胞的比例：將細胞消化成單個細胞，重懸后計數，將細胞調整為 1×106個/mL，離心后用 FACS 流式染液重懸，加入抗體(抗體∶細胞懸液 = 1∶100)，4 ℃避光孵育25 min后，用PBS洗滌1次后，進行流式細胞術檢測。所得數據使用 BD 公司的FlowJo X 軟件進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 乳腺腫瘤干細胞的富集和鑒定

小鼠乳腺癌細胞系 4T1 和4TO7 所形成的腫瘤細胞球的直徑基本都大于 70 μm，且數量較多(圖1A)。進一步，與貼壁的腫瘤細胞相比，腫瘤細胞球中干性基因 SOX2、OCT4和NANOG的 mRNA水平明顯上調(圖1B)，并且干性基因(SOX2 和 OCT4)的蛋白水平也明顯上調(圖 1C)。

2.2 乳腺腫瘤干細胞免疫檢查點與抗原遞呈相關分子的表達

PD-L1 和 CD276 在 4T1 的腫瘤干細胞中明顯下調，而 Gal-9 的表達明顯上調(圖2A)；在 4T07 的腫瘤干細胞中，PD-L1 和 CD47 的表達明顯上調，而 CD276 和 Gal-9 的表達明顯下調(圖2B)。抗原遞呈相關分子 B2m 在 4T1 和 4TO7 的腫瘤干細胞中都顯著上調，Nlrc5 的表達都明顯降低，而 Mr1、Tap2 和Tapbpl在這兩類乳腺癌干細胞中的表達趨勢相反(圖3)。

2.3 乳腺癌荷瘤小鼠的脾臟和腫瘤組織中各類免疫細胞的比例

圖4A 和圖5A 示圈門策略。在兩組荷瘤小鼠的脾臟中，CD4+T 細胞、CD8+T 細胞和 CD11c+MHCⅡ+DC 細胞所占的比例無明顯差異(圖4B～C,E)，然而 CD11b+細胞的比例在接種腫瘤干細胞的小鼠中明顯減少(圖4D)。

A.cellular morphology; B.mRNA levels; C.protein levels;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with adherent cells

A.4T1 cells; B.4TO7 cells; *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 compared with adherent cells圖2 小鼠乳腺腫瘤干細胞免疫檢查點分子的表達Fig 2 Expression of immune checkpoints of mouse breast cancer stem

A.4T1 cells; B.4TO7 cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with adherent cells圖3 小鼠乳腺腫瘤干細胞抗原遞呈相關分子的表達Fig 3 Expression of antigen presentation related molecules of mouse breast cancer stem

腫瘤組織的流式細胞測量術檢測顯示，兩組小鼠腫瘤組織中浸潤的免疫細胞(CD45+細胞)比例無明顯差異(圖5A)；但是，在接種了腫瘤干細胞的小鼠腫瘤組織中，CD4+T 細胞和 CD8+T 細胞的浸潤比例明顯增多(圖5B～C)，而CD11b+F4/80+巨噬細胞的浸潤比例明顯降低(圖5D)，兩組中 CD11c+MHCⅡ+DC 細胞的浸潤比例無明顯差異(圖5E)。提示，腫瘤干細胞可以招募更多的T 細胞，并且減少巨噬細胞的浸潤。

3 討論

腫瘤免疫檢查點的發現和應用獲得了2018年的諾貝爾生理學或醫學獎，標志著腫瘤免疫治療的新時代已經到來。盡管過去對于腫瘤干細胞的干性特征及其調控機制有較多研究[13-14]，但是目前關于腫瘤干細胞的免疫學特性卻鮮有報道。本研究結果顯示，腫瘤干細胞中免疫檢查點分子的表達進一步上調，并且不同類型的小鼠乳腺癌干細胞(4T1 和 4TO7)，其各種免疫檢查點分子的表達不盡相同，提示腫瘤干細胞可能具有獨特的免疫逃逸潛能，而且不同類型的腫瘤干細胞其發生免疫逃逸的分子機制并不相同，因此基于免疫檢查點理論的治療策略需要更加精細和準確。

小鼠乳腺癌細胞系 4T1和 4TO7經過成球培養后，其中一些幫助抗原加工與遞呈的分子(B2m和TAP1等)有所上調，這與我們預期的腫瘤干細胞抗原遞呈通路受損的免疫逃逸機制有些不一致。最近關于正常組織干細胞免疫原性的研究發現，在毛囊和小腸組織中，增殖活躍的干細胞通過 Nlrc5 轉錄激活MHCⅠ類分子的表達，從而被 T 細胞識別并清除[15]。本研究發現，Nlrc5在乳腺癌干細胞中確實低表達，推測其通過降低MHCⅠ類分子來逃脫機體的免疫監視，這些結果提示乳腺癌干細胞的抗原遞呈途徑并沒有完全失活，靶向其中的關鍵分子，例如Nlrc5，也許可以增加腫瘤干細胞的抗原暴露，利于機體免疫細胞對其特異性的清除。

A．gating strategies；B.CD4+ cells；C.CD8+ cells；D.CD11b+ cells；E.dendritic cells; *P<0.05,**P<0.01 comparedwith adherent group

A．gating strategies； B.CD4+ cells； C.CD8+ cells； D.CD11b+ cells； E.dendritic cells; *P<0.05 comparedwith adherent group

腫瘤干細胞形成的腫瘤組織中浸潤更多的CD4+T細胞和CD8+T細胞，然而與接種貼壁腫瘤細胞的小鼠相比，其腫瘤大小并沒有明顯的差異，推測，腫瘤干細胞雖然具有較高的免疫原性，但同時也更容易發生免疫逃逸來抵抗T細胞的清除。另外，也許腫瘤干細胞能夠招募更多適應性免疫細胞的原因是腫瘤干細胞中存在更為豐富的腫瘤相關抗原，通過靶向腫瘤干細胞抗原的同時解除免疫抑制狀態也許是腫瘤免疫治療成功的關鍵。

綜上所述，本研究通過分析腫瘤干細胞中免疫相關分子的表達和對免疫細胞的招募，初步探討了腫瘤干細胞的免疫原性及機體的免疫反應性，為進一步探討腫瘤干細胞發生免疫逃逸的可能機制，以及針對腫瘤干細胞免疫原性及其特異性抗原的腫瘤治療策略提供了一定的理論基礎。