非酒精性脂肪肝病模型小鼠的肝臟病理變化及肝細胞獲取方法

史冬雪，原佳琪，丁寶鋒，王小爽，余 佳

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種由非酒精因素導致的以肝臟細胞脂肪變性為主要特征的代謝綜合征，與較高的脂肪攝入量以及肥胖狀態相關聯[1]。 NAFLD包括單純的肝臟脂肪變性(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)以及肝纖維化等多個疾病階段[2]。隨著人們飲食結構的不斷變化，NAFLD的發病率逐年升高，在全球有超過25%的成年患者群體[3]。由于有著非常復雜的發病機制，人類對NAFLD的治療仍然面臨著巨大的挑戰。NAFLD小鼠模型的建立在研究NAFLD的發病機制、尋找潛在診療靶點方面發揮了非常重要的作用。

原代肝細胞是多種生物醫藥研究領域的基礎工具細胞，獲得高活力且高產量的原代小鼠肝細胞在技術上具有挑戰性。目前，獲取小鼠原代肝細胞主要基于經典的兩步膠原酶灌注技術及其改進方案來實行[4-6]，實驗中先用無鈣離子的緩沖液灌注肝臟，除去肝臟中的鈣離子，打破細胞與細胞之間的連接作用，再用含鈣的膠原酶溶液進一步消化，能夠獲得較高質量的原代肝細胞。但是當肝臟發生脂肪變性時，肝細胞變得脆弱，使用傳統的分離方法難以獲得高質量原代細胞，且在NAFLD小鼠中獲取原代肝細胞的技術仍然少有報道。本研究在傳統方法的基礎上，通過精準控制溫度、降低膠原酶濃度、使用低速離心和低速密度梯度離心等優化，使NAFLD小鼠中肝細胞活性和產量得到提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料: 用于建模的C57BL/6J雄性小鼠(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)60只，飼養于中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所動物實驗室；普通飼料(xt013，協同生物公司)；高脂飼料(D12492，Research Diets公司)。

1.1.2 主要試劑：DNase Ⅰ(10104159001，Roche公司)；Ⅳ型膠原酶、EGTA、D-(+)-葡萄糖(C5138、E4378、G8270， Sigma公司)；分離液 Percoll(17089102，GE公司)；10×D-Hank’s緩沖液、氯化鈣溶液、天狼猩紅染色試劑(H1046、G0070、S8060, 索萊寶公司)；煤油(K118401, 阿拉丁公司)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(391338, Merck公司)；RPMI 1640(011001, BI公司)；4%多聚甲醛(P4500, Lablead公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(10100147，Gibco公司)；0.4%錐蟲藍染色劑(T10282，Invitrogen公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S，碧云天公司)。

1.1.3 溶液配方：緩沖液 Ⅰ (Hank’s緩沖液, 5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2 mmol/L EDTA(EGTA), 0.1% 葡萄糖, pH 7.4);緩沖液Ⅱ(Hank’s緩沖液, 5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5 mmol/L CaCl2, 0.1% 葡萄糖, 0.4 mg/mL Ⅳ型膠原酶, pH 7.4);緩沖液 Ⅲ(RPMI 1640, 2 mmol/L CaCl2, 10% FBS, 1% DNase Ⅰ)。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD小鼠模型的建立：將60只7周齡的小鼠平均分成兩組：一組飼喂正常飼料(chow diet, CD)，作為對照組，另一組飼喂高脂飼料(high-fat diet, HFD)，作為實驗組。

1.2.2 肝臟組織形態學的檢測：取1 cm×1 cm×0.5 cm的小鼠肝臟組織，使用10倍體積的4%多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋，取5 μm的切片進行HE染色和天狼猩紅染色，評估其形態學的改變。

1.2.3 NAFLD小鼠肝臟細胞的獲取：1)緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ在42 ℃水浴中預熱，緩沖液 Ⅲ在冰上預冷。

2)麻醉小鼠：①制作30%異氟烷混合液[異氟烷∶煤油=3∶7(v/v)]。②在500 mL透明小室中，放入1 mL異氟烷混合液潤濕的紗布，小鼠在小室中麻醉1～2 min，待其翻正反射消失時取出。③用500 μL異氟烷混合液浸濕少許紗布，塞入50 mL離心管中，制作持續麻醉小鼠的鼻錐管。固定好小鼠，將鼻錐管靠近小鼠鼻子。

3)灌注及消化：①調整蠕動泵流速為20 mL/min，導管兩端同時插入緩沖液Ⅰ中，啟動蠕動泵排盡導管中氣泡備用。②插管: 用酒精消毒小鼠腹部，剪開腹部皮膚，向右翻開腸團，暴露出連接肝臟且位于腸系膜上的肝門靜脈。用手術線將門靜脈打虛結，將剪掉雙翼的留置針從下部小心插入門靜脈，旋緊留置針和導管接頭，緩慢轉動留置針使導管位置擺正, 單手按壓留置針固定。打開肝臟上方的加熱燈，調整到約20 cm的高度(圖1)。③調整蠕動泵流速為5 mL/min，用緩沖液Ⅰ 30 mL從門靜脈灌注肝臟，肝臟迅速膨起且顏色均勻變淺即為插管成功，此時迅速剪斷下腔靜脈釋放壓力。④更換緩沖液為緩沖液Ⅱ。每隔幾十秒用鑷子夾住下腔靜脈5 s，保證液體對肝臟進行充分灌注，夾住時可以看到肝臟變腫脹。隨著原位消化的進行，肝臟外觀會迅速變化，包括起伏變小、整體變大、邊緣模糊、肝臟根部有細小裂紋，灌注6～8 mL時，肝臟恰好不能再隆起時即為消化終點，此時迅速拔出留置針，關閉蠕動泵。 ⑤ 在35 mm平皿中準備不含Ⅳ型膠原酶的緩沖液Ⅱ 5 mL，加入DNase Ⅰ 50 μL。從根部取下肝臟，放入皿中，小心去除膽囊。用鑷子扯開肝包膜，輕輕晃動以釋放肝細胞，此時肝細胞應如云霧狀分散開。⑥將肝細胞懸液小心轉移到50 mL離心管中，置于冰上，用緩沖液Ⅲ 35 mL終止消化，輕輕顛倒幾次后，使用100 μm尼龍濾網過濾。

圖1 小鼠肝臟原位灌注示意圖Fig 1 Schematic diagram of in situ digestion in mice

4)分離細胞：① 肝細胞懸液過濾后，50×g離心3 min。獲得的細胞沉淀重懸于20 mL緩沖液Ⅲ，鋪在20 mL 40% Percoll 上，200×g離心10 min，以去除細胞碎片和非實質細胞。細胞沉淀用20 mL Hank’s緩沖液洗滌兩次，50×g離心3 min。所得沉淀即為原代肝細胞，加入適量Hank’s緩沖液重懸待用。②錐蟲藍染色確定細胞的活性。

5)注意事項：①由于蠕動泵的導管會沉積緩沖液中的鈣離子，術者需要定期用低濃度醋酸溶液清洗導管，否則膠原酶的消耗量會隨著鈣離子的沉積而逐漸增加。②進行肝臟原位消化時，由于小鼠個體差異，消化的時間不是一個定值，觀察消化終點十分重要，決定了肝細胞的產量和活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 正常(CD)組和高脂(HFD)組小鼠體質量變化

在造模的不同時間點，CD組和HFD組小鼠平均體質量均逐漸增長，HFD組增長幅度較大，顯著高于CD組 (P<0.01)(圖2)。

2.2 正常(CD)組和高脂(HFD)組小鼠肝臟病理特征觀察

2.2.1 小鼠肝臟HE染色結果:CD組肝臟結構完整，可見肝竇肝索，圍繞中央靜脈呈輻射狀排列；肝細胞呈圓形，細胞核位于肝細胞中央，胞質呈淡粉染色；肝臟間質未見炎性反應(圖3A)。

*P<0.01 compared with CD group圖2 CD組和HFD組的小鼠不同造模時間的平均體質量Fig 2 The average body weight of CD group and HFD group mice at different n=6)

HFD組肝臟在第5周時出現輕微空泡變性，胞質內可見少量細小脂滴(圖3B)；第10周時，肝細胞腫脹變性，胞質內存在大小不一的空泡，脂滴增多(圖3C)；第15周時，肝細胞胞質內可見大量圓形細小脂滴結構，部分肝細胞胞質完全被脂滴擠壓至消失，細胞核被擠壓至細胞一側，脂肪變性面積占1/3以上(圖3D)；第20周時， 病變細胞體積較大， 胞質被大量脂質物質充盈，呈淡粉至透明染色，細胞核體積小，有些細胞核被擠壓至細胞一側，脂肪變性細胞占整個組織的50%以上(圖3E)。

2.2.2 小鼠肝臟天狼猩紅染色結果:CD組小鼠肝臟的天狼猩紅染色呈陰性，肝細胞及間質內未見天狼猩紅陽性反應，僅在血管壁(含膠原纖維)可見紅色染色的陽性細胞(圖4A)。

HFD組小鼠第5、10、15周的肝臟天狼猩紅染色呈陰性，肝臟中央靜脈及其周圍膽管的管壁內膠原纖維成分呈紅色陽性染色，肝小葉間結締組織未見陽性，未形成纖維化(圖4B～D)；第20周的小鼠肝臟天狼猩紅染色呈弱陽性，肝細胞間質可見少量紅染的膠原纖維，血管壁(含膠原纖維)可見紅色染色的陽性細胞(圖4E)。

2.3 高脂(HFD)組小鼠原代肝細胞的獲取

傳統方法中，每只NAFLD小鼠獲得的肝細胞數目<2×107個，細胞存活率<60%，細胞純度<60%。肝細胞腫脹變大，邊緣粗糙，且有較多非實質細胞混雜(圖5A)；經過優化的本研究方法中，每只NAFLD小鼠可獲得5×107～7×107個肝細胞， 細胞存活率≥85%，細胞純度≥95%。新鮮分離的肝細胞透亮，呈圓形或橢圓形，邊緣平滑，聚團少(圖5B)。

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×20); D.hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes of mice in the CD group (×10); B.hepatocytes of mice at week 5 in the HFD group(×100); C.hepatocytes of mice at week 10 in the HFD group(×10); D:hepatocytes of mice at week 15 in the HFD group(×100); E.hepatocytes of mice at week 20 in the HFD group(×100)

A.hepatocytes obtained by conventional methods(×40); B.hepatocytes obtained by the optimized methods(×40)圖5 小鼠原代肝細胞的形態學觀察Fig 5 Morphology of primary mouse hepatocytes

3 討論

由于人類飲食結構的改變，全球NAFLD患者逐年增多。據報道, 50%的NAFLD患者會進展為肝纖維化，少數會發展成肝硬化，甚至最終進展為肝衰竭[7]。本研究模擬人類發病原因，利用高脂飲食誘導了NAFLD的小鼠模型，其中CD組小鼠無明顯脂滴沉積，未形成脂肪肝；HFD組小鼠由于飲食的改變，肝臟發生脂肪變性，病變面積隨著時間的延長逐漸增加，在15周時開始超過1/3，NAFLD模型構建成功[8]，到20周時脂肪變性面積已達50%以上，甚至開始出現肝纖維化。

NAFLD原代肝細胞接近機體肝臟病理狀態，在發病機制及藥物代謝等研究中扮演重要角色[9]。NAFLD 原代肝細胞相對于正常原代肝細胞更加脆弱, 難以分離，并且目前獲取NAFLD 原代肝細胞的研究仍比較少。本研究以經典的 Seglen 兩步灌流法為基礎[4-6]，改進得到了一種可以獲得高產量、高活性、高純度NAFLD原代肝細胞的方法。

在原位灌注小鼠肝臟時，本方法首先精準控制了消化的溫度，將緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ進行42 ℃預熱，麻醉時在肝臟上方使用加熱燈加熱，最大限度保證了消化酶的工作溫度接近37 ℃，一方面減少了對肝細胞的刺激，另一方面使消化酶更好地發揮作用，節省了Ⅳ型膠原酶的用量。其次，本研究將Ⅳ型膠原酶的濃度由傳統方法中的0.6 mg/mL降到0.4 mg/mL，使得消化更加溫和，容易找到一個更加精確的消化終點，既獲得了高產量的肝細胞，又提高了肝細胞的存活率。

對于體外分離肝細胞，目前大多實驗室主要采用直接靜置和密度梯度離心兩種方法，直接靜置會導致肝細胞純度下降，摻入過多肝臟非實質細胞。而常規的密度梯度離心由于離心力較大，往往對肝細胞的活性產生影響。普通肝細胞分離使用50% Percoll分離液，脂肪肝細胞由于有脂滴沉積而導致密度下降，故而采用常規的分離液濃度會降低肝細胞的產量。本研究采用低速(200×g)密度梯度離心和普通低速離心(50×g)相結合的方式，使用40% Percoll分離液，使肝細胞的活性、產量和純度進一步得到提高。

綜上，本研究構建了NAFLD的小鼠模型，揭示了第5、10、15和20周小鼠肝臟的病理特征，并構建了一種高效、穩定的獲取高質量NAFLD小鼠肝細胞的實驗方法，對小鼠模型中NAFLD的進一步研究有一定參考價值。