維生素D補充對多囊卵巢綜合征大鼠的保護作用

李翠梅， 高艷娥， 胡艷， 張良

(1.西安市第五醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西省西安市 710000；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西省西安市 710004；3.陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，陜西省西安市 710065)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種以雄激素分泌紊亂為特征，可導(dǎo)致患者周期性紊亂和多囊卵巢的疾病，上述情況會干擾和阻礙卵泡發(fā)育，導(dǎo)致少排卵/無排卵和不孕[1]?，F(xiàn)有研究表明，PCOS患者體內(nèi)睪酮和黃體生成素水平較高[2]，肥胖和胰島素抵抗風(fēng)險也更高[3]。有研究已經(jīng)證實了PCOS患者維生素D(vitamin D，VitD)缺乏(<50 nmoL/L)、肥胖、胰島素抵抗和不孕之間的關(guān)系，并將VitD缺乏確定為導(dǎo)致高雄激素血癥的主要因素[4]。以往的研究強調(diào)了VitD在女性生殖功能中的作用，如類固醇生成，可促進顆粒細胞增殖、卵母細胞活化、排卵和卵泡發(fā)育[5]。雖然VitD缺乏在PCOS患者中普遍存在，但補充VitD在PCOS患者中的作用尚不完全清楚。因而，本研究旨在評估VitD對PCOS大鼠卵泡發(fā)育、性激素變化和胰島素抵抗的影響，以為臨床提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物、儀器和試劑

40只雌性SD大鼠(8周)購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，24 ℃受控照明(12 h光-暗循環(huán))下自由飲食。40只大鼠隨機分為對照組、PCOS組、VitD組和VitD+PCOS組，每組10只。倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；HE染料(美國Sigma公司)；戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)。

1.2 PCOS模型制備及干預(yù)

大鼠腹部肌肉注射戊酸雌二醇(2 mg/kg)，60天后通過陰道涂片和血清學(xué)檢查證實PCOS模型制備成功[6]。PCOS模型制備后，將2 mg VitD溶解在二甲基亞砜溶液中，VitD組和VitD+PCOS組大鼠每天皮下注射VitD(1 mg/kg)，共14天。干預(yù)結(jié)束后，測量大鼠卵巢質(zhì)量和體質(zhì)量。然后麻醉大鼠，心臟抽5 mL血液，3 000 r/min離心10 min，收集血漿于-70 ℃儲存。

1.3 組織病理學(xué)觀察

麻醉處死大鼠，切除卵巢，立即固定于4%多聚甲醛溶液中，乙醇脫水，二甲苯清除，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。如果卵泡卵母細胞完整，顆粒細胞層完整，則視為正常卵泡；如果顆粒細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡化和核固縮，且偶爾觀察到卵母細胞萎縮，則視為閉鎖卵泡。根據(jù)卵泡發(fā)育階段將其分為原始卵泡、初級卵泡、腔前卵泡和腔卵泡。當(dāng)卵母細胞的細胞核顯影時進行組織形態(tài)計量學(xué)分析，計數(shù)所有卵泡，重復(fù)計數(shù)3次取均值。

1.4 卵泡活力的觀察

在顯微鏡下機械分離不同時期卵泡，并通過膜包裹的顆粒細胞和中央卵母細胞進行評估。卵巢濾泡用0.4%臺盼藍染色，倒置顯微鏡檢測。如果卵母細胞和周圍顆粒細胞被染色，則卵泡被認為是正常；如果中央卵母細胞和周圍顆粒細胞未被染色，則認為是退化卵泡。卵泡活力(%)=正常卵泡/(正常卵泡+退化卵泡)×100%。

1.5 性激素及胰島素的測定

按照說明書使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，測定卵泡刺激素、黃體生成素、睪酮、孕酮、雌二醇水平。采用全自動生化分析儀分析血糖和胰島素水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量的比較

與對照組比較，PCOS組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量均增加(P<0.05)；與PCOS組大鼠比較，VitD+PCOS組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量均降低(P<0.05；表1)。

表1 補充VitD對PCOS大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量的影響

2.2 各組大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

對照組和VitD組大鼠組織學(xué)觀察表明，不同發(fā)育階段卵巢卵泡正常完整(圖1A和C)。相比之下，PCOS組大鼠腔前卵泡和腔卵泡顯示出更多的退化跡象，包括顆粒細胞固縮、顆粒細胞層變薄和大量閉鎖卵泡(圖1B和圖2)。VitD+PCOS組大鼠卵泡發(fā)育良好，觀察到正常顆粒細胞和卵膜細胞層(圖1D)，說明VitD干預(yù)后PCOS大鼠卵泡成熟(卵泡發(fā)生)并排卵。

圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色(40×)A為對照組；B為PCOS組；C為VitD組；D為VitD+PCOS組。

圖2 PCOS大鼠卵泡發(fā)育的不同階段(200×)A為腔前卵泡;B為腔卵泡;C為閉鎖卵泡。

2.3 各組大鼠卵泡形態(tài)和活力比較

與對照組比較，PCOS組不同發(fā)育階段卵泡數(shù)量顯著減少，正常卵泡數(shù)量顯著降低，而閉鎖卵泡數(shù)量明顯增多(P<0.05)；與PCOS組比較，VitD+PCOS組上述變化趨勢明顯改善(P<0.05；表2)。

表2 補充VitD對PCOS大鼠卵泡形態(tài)的影響 單位：個(%)

與對照組比較，PCOS組不同發(fā)育階段卵泡活力均降低(P<0.05)；與PCOS組比較，VitD+PCOS組不同發(fā)育階段卵泡活力顯著提高，且不同發(fā)育階段退化卵泡活力顯著降低(P<0.05；表3)。

表3 補充VitD對PCOS大鼠卵泡活力的影響 單位：個(%)

2.4 各組大鼠性激素和胰島素等指標(biāo)的比較

與對照組比較，PCOS大鼠血清黃體生成素、睪酮、胰島素、血糖和胰島素抵抗顯著升高，卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平顯著降低(P<0.05)；與PCOS組比較，VitD+PCOS組上述變化趨勢明顯改善(P<0.05；表4)。

表4 補充VitD對PCOS大鼠性激素、血糖、胰島素和胰島素抵抗的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量增加；PCOS大鼠卵巢中不同發(fā)育階段正常卵泡數(shù)量和活力減少，閉鎖卵泡數(shù)量增多；PCOS大鼠血清黃體生成素、睪酮、胰島素、血糖和胰島素抵抗水平升高，卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平降低。而補充維生D后，可以改善上述指標(biāo)，這可能與VitD補充降低睪酮水平有關(guān)。本研究PCOS大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察顯示，在不同發(fā)育階段有大量卵泡受損，顆粒細胞萎縮，卵泡膜變?。籚itD補充可使PCOS大鼠卵泡發(fā)育良好，觀察到正常的顆粒細胞和卵泡膜細胞層。近期有研究報道，脫氫表雄酮誘導(dǎo)PCOS大鼠皮下注射VitD后，與PCOS組比較，VitD組大鼠卵巢切片顯示閉鎖卵泡和囊狀卵泡數(shù)量目減少，同時卵巢功能恢復(fù)[6]。與其研究一致，在本研究中，PCOS大鼠發(fā)育各階段閉鎖卵泡增加，生長卵泡和卵泡發(fā)育受損，而補充VitD可改善PCOS的不良作用。以往研究表明，VitD在卵巢類固醇激素的生成中起到重要的調(diào)節(jié)作用，VitD水平與抗繆勒氏管激素具有相關(guān)性，從而提高了卵泡刺激素的敏感性，促進卵泡發(fā)育成熟和排卵[7]。

PCOS是激素紊亂原因之一，可導(dǎo)致不明原因的不孕。VitD缺乏和高雄激素血癥是PCOS發(fā)病和發(fā)展過程中的常見癥狀，提示VitD水平與睪酮水平呈負相關(guān)，VitD缺乏可引起高雄激素血癥[8]。本研究與Pal等[9]研究一致，證明PCOS患者補充VitD后睪酮水平顯著降低。有研究證實，VitD缺乏通過鈣失調(diào)引起卵泡發(fā)育停止或受損，從而導(dǎo)致月經(jīng)不調(diào)、排卵和生育功能障礙[10]。本研究結(jié)果證實VitD在卵子發(fā)生和卵母細胞成熟中的關(guān)鍵作用。VitD缺乏可能是PCOS卵母細胞發(fā)育障礙的原因。也有研究表明，VitD在血清性腺類固醇生成中也有作用[11]。在本研究中，VitD可能通過改善PCOS大鼠的芳香化酶活性和黃體生成素來提高雌激素水平。此外，在本研究中，PCOS大鼠卵泡刺激素水平降低，黃體生成素水平升高，卵泡成熟受損，形成多個囊性卵泡。VitD可能通過抑制抗繆勒氏管激素表達誘導(dǎo)顆粒細胞分化，從而使卵泡達到終末成熟。此外，在黃體化的顆粒細胞中，VitD導(dǎo)致顆粒細胞對卵泡刺激素依賴性降低，而對黃體生成素依賴性增加，從而使成熟卵泡排卵[12]。本研究結(jié)果證明，VitD通過增加雌激素和孕酮水平以及調(diào)節(jié)卵泡刺激素和黃體生成素比率促進PCOS大鼠卵泡發(fā)育。

有研究發(fā)現(xiàn)，VitD缺乏與PCOS各種癥狀有關(guān)，包括胰島素抵抗、不孕和多毛癥等[13]。在本研究中，補充VitD可降低PCOS大鼠血糖或胰島素水平，PCOS大鼠存在胰島素抵抗。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗在PCOS患者中很常見，VitD缺乏也與胰島素抵抗有關(guān)[14]。有證據(jù)表明，VitD可能通過刺激卵巢組織中胰島素受體、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)表達來降低胰島素抵抗，從而增加胰島素敏感性[15]。而胰島素抵抗和肥胖與PCOS婦女VitD缺乏和促性腺激素分泌減少有關(guān)[16]。本研究結(jié)果提示，VitD補充可能與改善PCOS大鼠胰島素敏感性和有效性有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，PCOS大鼠補充VitD后可能通過調(diào)節(jié)性激素及胰島素敏感性，促進正常卵泡發(fā)育。因此，本研究進一步驗證補充VitD可以保護卵巢組織免受PCOS影響。