依達拉奉改善大鼠心肌缺血損傷和炎癥反應

王娟， 顧順忠， 陸洋， 顏永進

(海安市人民醫院心內科，江蘇省海安市 226600)

冠心病的主要發病原因是冠狀動脈堵塞和栓塞導致心肌缺血缺氧性壞死，炎癥在心肌缺血損傷的發展中起著關鍵作用[1]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一個與炎癥反應相關的重要因子，參與機體的各種生理過程[2]。信號誘導的泛素化及隨后NF-κB抑制劑(inhibitor of NF-κB,IκB)的降解是通過IκB激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)的激活啟動的[3]。一旦IκB降解，NF-κB復合體轉移到細胞核，以調節特定基因的表達[4]。依達拉奉是一種腦保護劑，能夠強效清除體內的自由基及抑制脂質過氧化，抑制體內的氧化應激反應[5]。目前依達拉奉在心肌損傷中的研究主要聚焦于抗氧化作用，而關于抗炎作用暫不清楚。因此，本研究著重于探究依達拉奉在心肌缺血損傷中的作用及機制研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和動物

依達拉奉購自美國Sigma公司。蘇木精和伊紅購自索萊寶公司；組織細胞凋亡試劑盒(TUNEL)購自凱基公司；廣譜蛋白酶、磷酸酶抑制劑混合物和BCA試劑盒組織裂解液購自碧云天公司；p-IKKα/β、p-p65、p65抗體及β肌動蛋白(β-actin)購自Abcam公司；熒光二抗購自奧德賽公司。無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性SD大鼠24只，體質量(220±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號SCXK(京)2012-0001，實驗動物飼養、使用和操作均按照本單位倫理委員會標準程序執行。

1.2 心肌梗死模型的建立

采用隨機數字表法將24只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和依達拉奉組，每組8只。異氟烷麻醉大鼠后，結扎冠狀動脈左前降支建立心肌損傷模型，具體步驟見文獻[6]。假手術組不結扎。所有大鼠術后給與抗生素預防感染，并用胸導聯檢測是否有ST段弓背向上型抬高。依達拉奉組術后1 h內尾靜脈給與依達拉奉3 mg/kg，連續14天；模型組給與等量生理鹽水。假手術組不結扎冠狀動脈。

1.3 超聲心動圖測量

所有大鼠麻醉后仰臥位固定，取左側胸骨旁短軸切面，用小動物超聲儀收集超聲心動圖數據，并檢測左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室縮短分數(left ventricle shortens fraction,FS)、左心室后壁舒張期末厚度(end diastolic thickness of left ventricular posterior wall，LVPWd)。所有測量和分析都采取雙盲法，由經驗豐富的超聲科技術人員進行。

1.4 心肌組織炎癥因子的檢測

收集大鼠心臟組織，液氮冷凍后研磨成粉，然后加入RIPA裂解液裂解0.5 h，離心后吸取上清液。采用ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司)檢測心肌組織炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.5 免疫蛋白印跡法

取心臟組織，提取總蛋白。取20 μg蛋白樣品加入4%～20%預制膠，電泳，轉膜。將醋酸纖維素膜轉移至5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，然后加入一抗P-IKKα/β、p-p65(1∶300)、p65(1∶500)與β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST充分洗膜3次，每次5 min，然后用血清稀釋的免疫熒光二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后用Odyssey曝光儀掃描，然后用Image J分析灰度值，所有目的蛋白都用β-actin做標準化處理。

1.6 心肌梗死面積評估

心臟組織經多聚甲醛固定后，進行石蠟切片，切片厚度5 μm。將切片置于0.2%氯化硝基四氮唑藍液(NBT)溶液室溫孵育3 min，再用福爾馬林浸泡，封片拍照。心肌梗死區未著色，心肌梗死面積比為梗死面積占整個心臟截面的百分比。

1.7 心肌細胞凋亡檢測

取大鼠心臟切片，切片厚度5 μm。脫蠟清洗后采用原位細胞凋亡試劑盒TUNEL染色。先加入0.5%Triton X-100處理10 min，再加入TUNEL反應混合物37 ℃孵箱中孵育30 min。最后加入1 mg/L細胞核染色劑室溫孵育3 min。使用激光掃描共焦顯微鏡觀察和計數TNUEL陽性細胞。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 各組超聲心動圖結果的比較

與假手術組比較，模型組大鼠LVPWd增加(P<0.05)，LVEF及FS降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組LVPWd降低(P<0.05)，而LVEF、FS增加(P<0.05；表1)，表明依達拉奉組較模型組大鼠心功能顯著改善。

表1 各組超聲心動圖結果的比較(n=8)

2.2 各組大鼠心肌組織炎癥因子水平的比較

與假手術組比較，模型組大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組IL-1β、IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05；圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織炎癥因子水平的比較a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況的比較

與假手術組比較，模型組凋亡心肌細胞率上升(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組凋亡心肌細胞率降低(P<0.05；圖2)。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況的比較(TUNEL染色，20×)a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.4 各組大鼠心肌梗死面積的比較

與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增大；與模型組比較，依達拉奉組心肌梗死面積顯著降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組大鼠心肌梗死面積的比較(NBT染色)未著色區域為心肌梗死區域。a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.5 各組大鼠NF-κB信號通路的比較

與假手術組比較，模型組心肌組織P-IKKα/β、p-p65、p65水平顯著升高，而依達拉奉組P-IKKα/β、p-p65、p65水平低于模型組(P<0.05；圖4)。

圖4 各組大鼠NF-κB信號通路的比較a為P<0.05，與假手術組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

心肌缺血缺氧損傷是冠心病的重要臨床特征，也是目前心血管領域引起患者死亡的重要原因[1]。心肌缺血損傷引起心肌細胞壞死、氧化應激、炎癥風暴等病理過程，最終導致心力衰竭[2,7-8]。因此，靶向于心肌缺血損傷是治療冠心病的重要臨床干預策略[9]。

本研究探討了依達拉奉對心肌損傷的改善作用，通過結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血損傷模型，再給與依達拉奉干預。超聲結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠LVPWd顯著增加，而LVEF及FS顯著降低，表明心肌梗死模型成功建立；與模型組比較，依達拉奉組LVPWd顯著降低，而LVEF、FS顯著增加，提示依達拉奉對大鼠心肌損傷后心功能有一定改善作用。心功能改善是基于病理的改變，進一步通過NBT染色觀察了心肌組織的病理改變。結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增多；與模型組比較，依達拉奉組心肌梗死面積顯著降低。此外，心肌細胞凋亡在心肌缺血損傷后與疾病的預后密切相關。心肌缺血后，心肌細胞啟動程序性細胞凋亡，形成凋亡小體，然后誘導細胞內蛋白酶的活化介導心肌細胞的死亡。心肌細胞的凋亡也是決定心肌損傷是否轉向心力衰竭的重要因素。本研究通過TUNEL染色觀察了心肌損傷依達拉奉治療后心肌細胞凋亡的情況，結果顯示，依達拉奉能顯著改善心肌損傷導致的細胞凋亡。

依達拉奉是一種強效的氧自由基清除劑，臨床常用于治療腦卒中，并獲得了較好的臨床效果[10]。依達拉奉在急性心肌缺血缺氧中的作用尚不完全明確。近年來的研究提示依達拉奉也具有顯著的抗炎作用，目前已經在神經退行性疾病中得到驗證[11]。過度的炎癥反應，包括炎癥因子風暴、單核巨噬細胞的激活是加重心肌缺血損傷的重要因素。因此，本研究探究了依達拉奉是否能夠抑制心肌缺血損傷后的炎癥反應，結果顯示，心肌缺血損傷組大鼠心肌組織的炎癥因子水平顯著升高，依達拉奉干預后炎癥因子水平顯著降低，提示依達拉奉具有抑制炎癥反應的作用。炎癥反應是由多種信號通路共同調控的，其中NF-κB是一個與炎癥反應相關的重要分子，細胞質IκB降解后，NF-κB復合體轉移到細胞核，從而發揮基因調控功能。本研究發現，依達拉奉能夠顯著抑制NF-κB信號通路的活化，從而降低了NF-κB信號通路調控的炎癥反應激活。

綜上所述，本研究發現依達拉奉能夠通過抑制NF-κB通路改善心肌缺血損傷和炎癥反應。