糖皮質激素受體在缺血再灌注腎損傷中的作用

王向東 姜 敏 王 鑫 鞏永鳳*

(1.濱州醫學院生理學教研室，山東煙臺 264000；2.濱州醫學院藥理學教研室，山東煙臺 264000；3.青島大學病理生理學教研室，山東青島 266000)

腎損傷是一個全球性疾病，具有高發病率、高病死率和低治愈率的特點，多由缺血再灌注、腎毒性藥物的使用和膿毒敗血癥等病因導致[1-2]。其中，缺血再灌注是腎損傷的主要誘因，主要有腎功能下降，血清中含氮廢物排出減少等臨床表現。腎小管的損傷與修復是腎功能損傷程度的主要標志[1]，當損傷因素過強應激反應不能及時被終止時，則會導致腎功能的進一步損傷并促使之后一系列不可逆過程的發生，沿著急性腎損傷→慢性腎功能衰竭→終末期腎病→尿毒癥這一過程進展[3-5]。因此，探究腎損傷發生發展的機制并找到有效延緩腎損傷發展的治療方法，對目前臨床治療腎損傷從而提高腎損傷患者生活質量尤為重要。

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)誘導腎損傷的具體致病機制至今尚未完全闡明，目前已有研究[6-8]報道與之有關的有炎癥反應、上皮間質轉分化、內質網應激和線粒體損傷等原因，其中炎性反應在腎損傷的發生和發展過程中起到了至關重要的作用，腎損傷和炎性反應相關通路有關。

糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)作為一個主要靶點，在炎性反應的發生過程中起到了至關重要的作用。GR分布于全身各個組織和細胞內，正常情況下，大部分存在于細胞胞質內，和熱休克蛋白結合以維持其正常構象；當受到某些激活因子刺激后，GR和熱休克蛋白分離并發生轉位，進入細胞核內，發揮其轉錄特性，減弱相應轉錄因子的活性[9-10]。探究GR在IR誘導的腎損傷中的作用，不僅可以探究炎性反應在IR誘導的腎損傷中的作用方式，同時也有助于發現在腎損傷中更多與GR相關聯的分子，從而對腎損傷進一步深入的了解。

本研究通過構建IR誘導小鼠腎損傷模型，觀察腎小管在該過程中的損傷與修復；通過注射米非司酮(mifepristone, MF)阻斷GR入核，進一步加重腎損傷和炎性反應，深入探究了GR在腎損傷中的作用，為進一步探究GR在腎損傷中的作用提供合適的模型和方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡C57BL/6雌性小鼠，體質量約20～22 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(魯)2019-0003。自由飲水攝食，12 h光照周期。倫理審批號：2021-172。

1.2 試劑

Trizol(美國Ambion公司)；實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；米非司酮(美國MCE生物科技公司)；RIPA裂解液、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒(南京建成科技有限公司)；DAPI(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白質濃度定量試劑盒(日本Takara公司)；反轉錄試劑盒(日本Takara公司)；腎損傷分子-(kidney injury molecular-1，Kim-1)抗體、GR抗體、巨噬細胞表面標志物F4/80抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗(美國CST公司)；近端小管標志物Lotus Tetragonolobus Lectin(LTL)(美國Vector Laboratories公司)。

1.3 實驗分組及處理

小鼠數字表法隨機分為5組，每組10只，用來驗證模型構建成功以及 GR 在缺血再灌注過程中的變化，分別為空白對照組，缺血再灌注后4、14、30和79 d組。

另外再取20只小鼠，數字表法隨機分為兩組，每組10只分別作為MF組和對照組，用來驗證MF對腎損傷的影響，將MF溶解于DMSO中，使用時用玉米油稀釋，于缺血再灌注的前一天，MF組小鼠腹腔注射含有MF的溶劑，對照組注射等劑量但不含藥物的相同溶劑，以排除DMSO和玉米油對腎臟的影響。

1.4 IR模型構建

小鼠適應環境1周后，腹腔注射20 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，待完全麻醉后備皮，置于38 ℃金屬水浴鍋上10 min以恢復體溫。膠帶固定四肢，碘伏消毒，剪開左側皮膚，暴露單側腎臟以及腎蒂，使用微血管夾，夾閉動靜脈45 min后，取下微血管夾，恢復腎臟血液供應，縫合皮膚。缺血再灌注后4、14、30、79 d組分別于處理前一天麻醉后切除對側腎臟，次日摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腎臟。

1.5 腎組織取材

每組取6只小鼠的腎臟使用Trizol勻漿，提取RNA，進行RT-qPCR。取2只小鼠的腎臟沿縱軸切開，一半使用4%(質量分數)多聚甲醛固定，常規脫蠟、浸石蠟包埋切片進行過碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining，PAS)、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)。一半OCT包埋，置于-80 ℃冰箱，用于免疫熒光染色；其余小鼠腎臟取出后置于液氮速凍，置于-80 ℃冰箱，用于蛋白質印跡技術(Western-blotting，WB)檢測。

1.6 血清的制備及保存

血液室溫靜置2 h后，4 ℃，3 000g離心15 min。收取上清，-80 ℃凍存。

1.7 腎組織RNA提取

去除腎臟被膜，置于1.5 mL Trizol內，勻漿30 s。取1 mL勻漿后的液體置于1.5 mL EP管內，室溫靜置10 min，加入氯仿200 μL/mL，用力震蕩15次充分混勻，室溫靜置3～5 min，4 ℃，12 000g離心15 min。溶液分3層，分2次取出上層400 μL水相置于新的1.5 mL EP管內，加入預冷的異丙醇500 μL，翻轉4～5次混勻，室溫靜置10 min。4 ℃，12 000g離心10 min。棄上清，1 mL 75%(體積分數)乙醇洗2遍，4 ℃，7 500g離心5 min，加入DEPC水置于金屬水浴鍋內55 ℃孵育10 min溶解RNA，置于-80 ℃冰箱，用于RT-qPCR。

1.8 RT-qPCR

按照試劑盒說明進行反轉錄和熒光定量PCR，最終結果使用循環閾值(CT值)減去β-actin的CT值，計算目的基因的2-△△Ct值，比較目的基因相對表達水平。引物序列詳見表1。

表1 mRNA引物序列(小鼠)

1.9 腎組織免疫熒光染色

將OCT包埋的腎組織使用冷凍切片機切成8 μm厚度，甲醇-20 ℃固定20 min，使用含10%(體積分數)胎牛血清和1%(體積分數)Tween 20的PBS封閉液封閉90 min，一抗為兔抗GR單克隆抗體(1∶200)和鼠抗F4/80單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，封閉液洗3次，二抗兔抗羅丹明和鼠抗FITC、腎臟近端小管染料LTL(1∶400)，室溫孵育2 h，封閉液洗3遍，DAPI室溫避光染核5 min，封閉液洗3遍，封片。使用880激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM880，德國蔡司)觀察拍照。

1.10 蛋白質印跡實驗

從-80 ℃取出腎臟，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿后用2 mL注射器抽吸50次以充分裂解組織，置于4 ℃翻轉混勻30 min，4 ℃，12 000g離心15 min，取上清，BCA法測濃度后調整上樣量。按照實驗分組加入蛋白樣品，10%(質量分數)Tris-HCL SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，轉移到硝酸纖維素膜上恒流200 mA轉膜2 h，然后使用5%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗(抗GR、抗β-actin抗體，1∶1 000)過夜。次日TBST清洗3次后，避光孵育二抗(HRP標記的山羊抗小鼠IgG，1∶2 000)室溫1 h，使用ECL發光液孵育2 min后顯影。

1.11 腎組織PAS和HE染色

取出4%(質量分數)多聚甲醛固定的腎臟，按照常規組織脫水浸蠟切片步驟[11]，進行組織學染色，光學顯微鏡觀察腎組織炎性細胞浸潤和損傷情況。

1.12 MF干預

MF是GR阻斷劑。先用DMSO將MF粉末配溶解成100 mg/mL的原液，使用時再用玉米油稀釋成10倍工作液，實驗組于缺血再灌注手術前一天開始第一次腹腔注射，每次注射劑量為50 mg/kg，每天注射1次，連續注射15 d，以阻斷GR入核[12-13]；對照組注射等劑量玉米油和DMSO 混合溶劑。

1.13 統計學方法

2 結果

2.1 缺血再灌注對小鼠腎功能影響

腎臟缺血再灌注構建過程(圖1A)。通過BUN和Scr試劑盒檢測小鼠腎功能發現，與空白組相比，腎臟缺血再灌注組小鼠各觀察時間點的BUN和Scr均高于對照組，差異有統計學意義。BUN：F=200.6，P<0.01，每組值分別為：空白組：(16.06±1.05)mg/dL，單側缺血再灌注(unilateral ischemia-reperfusion, UIR)(day 4)+單側腎切除(unilater nephrectomy, UNX)(day 1):(78.43±3.51)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(29.24±2.92)mg/dL，UIR(day 30):(23.94±5.07)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(19.81±5.83)mg/dL。Scr：F=63.43，P<0.01，每組值分別為：空白組：(0.20±0.07)mg/dL，UIR(day 4)+UNX(day 1)：(1.67±0.32)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(1.12±0.07)mg/dL，UIR(day 30)+UNX(day 1):(0.34±0.06)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(0.35±0.07)mg/dL；n=6。再灌注后第4天組BUN和Scr濃度最高，隨后逐漸降低(圖1B)。PAS染色顯示，模型組相比空白組小管結構紊亂，腎間質浸潤細胞增多(圖1C)。免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測顯示，和空白組相比，缺血再灌注第14天近端小管標志物LTL信號降低，Kim-1陽性信號明顯增多，隨后逐漸減弱(圖1D)。

圖1 缺血再灌注對小鼠腎功能的影響

2.2 GR和腎臟炎癥反應的相關性

腎組織HE染色顯示，缺血再灌注后腎間質會出現大量細胞聚集(圖2A)。RT-qPCR檢測結果顯示，模型組巨噬細胞表面標志物F4/80、T細胞表面標志物CD3以及中性粒細胞表面標志物Ly6G均高于空白組，差異有統計學意義(F4/80:F=11.31，P<0.01；CD3:F=15.9，P<0.05；Ly6G：F=4.469，P<0.05，n=6)，詳見圖2B。IF檢測顯示，與空白組相比，模型組F4/80陽性信號明顯增強，CD3陽性信號輕度增強，同時，GR的表達和炎性反應存在一個負相關性，詳見圖2C。

圖2 腎臟炎癥反應和GR的關系

2.3 GR在IR誘導腎損傷過程中的變化

RT-qPCR檢測結果顯示，GR的mRNA在IR誘導腎損傷后明顯降低，與空白組比較差異有統計學意義(F=46.84，P<0.001，n=6)，急性期顯著下降，但隨觀察時間的增加呈現逐漸恢復的趨勢(圖3A)。免疫熒光結果(圖3B)和蛋白質印記實驗結果表明，GR的蛋白質水平也呈現先降低后逐漸恢復的趨勢(圖3C)。

圖3 GR在缺血再灌注過程中的變化

2.4 GR阻斷后會加重IR誘導的腎損傷

腹腔注射MF后，實驗組腎功能指標Scr和BUN均高于對照組，差異有統計學意義[BUN：50.82±3.91)mg/dLvs(60.45±3.20)mg/dL，P<0.01；Scr：(1.05±0.23)mg/dLvs1.71±0.08，P<0.01，n=6)]，說明腎功能損傷加重(圖4A)。IF檢測結果顯示，使用米非司酮后F4/80和Kim-1陽性信號明顯增強，說明炎性反應增強，腎損傷加重(4B，4C)。

圖4 GR阻斷對IR誘導腎損傷的影響

3 討論

炎性反應參與了多種疾病的發生發展，當組織遭受應激性刺激時，受損細胞會釋放大量促炎因子，募集炎癥細胞引起炎性反應從而減輕損傷。隨著損傷的消除，抑炎因子釋放，炎性反應逐漸消退，開始進入組織修復過程。然而，過度和未被及時終止的炎癥會導致免疫系統紊亂、組織損傷和纖維化的發生[14]。正常情況下，多種炎癥細胞參與了機體穩態的維持和受損組織的重建，尤其是巨噬細胞，參與調節組織對損傷或應激因素的反應[15-17]。本實驗在已有研究的基礎上，進一步探究了近端小管的損傷與修復，包括腎損傷分子Kim-1的表達變化以及巨噬細胞、T細胞和中性粒細胞3種炎性細胞在腎損傷發展過程中浸潤數量的變化。

腎小管是對IR和腎毒性藥物損傷最敏感的部位，主要表現為腎小管上皮細胞凋亡，炎性反應的啟動和纖維化的發生，如果損傷過強或者反復多次損傷，會導致腎臟的不適應性修復，進而導致腎纖維化和慢性腎衰竭[18-19]。本研究結果表明，IR會導致腎臟發生嚴重損傷，誘發大量的巨噬細胞，CD3+T細胞和中性粒細胞浸潤，并且不同類型炎癥細胞出現和消退的時間存在差異。腎損傷的免疫炎癥由天然免疫和獲得性免疫反應共同參與，二者在組織損傷和修復中均具有雙刃劍效應，其復雜的調控網絡遠未闡明。比如，在疾病的不同階段，不同的炎癥細胞卻起到了相反的效應，即便同樣是巨噬細胞，不同分型的巨噬細胞對于腎臟的損傷和修復也起到了截然相反的效應。因此，探究炎性反應在腎損傷過程中的作用并且恰當地利用炎癥反應治療和控制腎損傷的發生發展尤為重要[20-22]。

GR作為機體炎性反應的重要靶點，存在于機體各種細胞，大部分位于細胞內，極少部分位于細胞膜上，在正常生理狀態下，GR和熱休克蛋白結合位于胞質內，當機體受到損傷而發生炎癥反應時，糖皮質激素釋放增多，糖皮質激素便會和GR結合，從胞質轉移至細胞核內，結合在GRE區域，進而誘導下游靶基因表達，發揮其抗炎的作用。此外，GR還可以和一些核分子結合抑制其轉錄活性，比如核因子-κB和激活蛋白-1，減弱其促炎作用而發揮抗炎效應[23-25]。MF，俗稱RU486是孕激素和糖皮質激素的競爭性拮抗劑，可以阻斷糖皮質激素和GR以發揮其作用，注射MF阻斷GR時，會導致炎性反應增強和器官損傷。有研究[26]顯示，燒傷小鼠注射MF會逆轉糖皮質激素的修復作用，使血管修復受阻，血管壁通透性增加，導致肺和腎功能嚴重受損，進而誘發多器官功能衰竭。此外，給脂多糖誘導的膿毒敗血癥小鼠注射MF后，發現MF抑制早期膿毒癥中p38的激活，以及晚期膿毒癥中p42/44 MAPK的激活[27]。然而，GR在IR誘導的腎損傷中的變化及作用尚未被深入探究。本研究表明，GR在IR誘導的腎損傷發生過程中存在時間依賴性，說明GR在該過程中起到了重要的作用。因此，探究GR在腎損傷過程中的作用，有望為臨床治療腎損傷提供一個新的藥物靶點[9，28]。

MF作為孕激素和糖皮質激素受體阻斷劑被大量研究，同時也已經作為避孕藥在臨床推廣應用，截至目前，未發現 MF 在正常生理狀態下對腎功能存在毒副作用[29-30]，已有研究[31]表明在肝腎功能正常的情況下，使用MF對肝腎功能沒有影響。同時，本研究發現，在IR誘導的腎損傷中，腹腔注射MF阻斷GR入核發揮轉錄調控作用時，腎小球濾過率相比對照組明顯下降，腎損傷進一步加重。本實驗還發現，腹腔注射MF會進一步導致IR誘導腎損傷后腎組織炎癥細胞的浸潤增多，加重腎臟損傷，說明腎臟中的GR可能通過抑制炎癥細胞的浸潤，進而保護腎臟免受IR誘導的損傷。

本次實驗證實了GR和IR誘導腎損傷有明顯的相關性并且起到了重要的作用，但作用的具體機制以及與炎癥因子互作而調控炎性反應強度尚未闡明。接下來可以通過構建和GR相關分子的基因敲除小鼠，在IR誘導腎損傷模型的基礎上，通過基因組學和蛋白質組學進一步驗證和探究。本次通過在IR誘導的腎損傷小鼠模型上，注射MF阻斷GR，證實了GR阻斷后會進一步加重IR誘導的腎損傷，為今后深入探究GR在腎損傷發生發展過程中的具體機制提供實驗思路和實驗方法。