實時熒光定量PCR法鑒定嬰幼兒配方乳粉中動物雙歧桿菌乳亞種

王青龍，貌 達，周燕霞，李 爽，王雨婷，楊 霞，冉令輝，李慶堯，王凱毅，湯娛涵，丁珊珊，蔡雪鳳*

（1.北京食品安全監控和風險評估中心（北京市食品檢驗所），北京 100094；2.中國計量科學研究院 化學計量與分析科學研究所，北京 100029）

益生菌是能夠為人類提供健康益處的活微生物的統稱，主要是能夠利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌，其能夠改善消化系統健康、預防感染性腹瀉、腸應激綜合征和炎癥性腸病等[1-3]。但益生菌的健康益處具有菌種或菌株特異性，并非所有的乳酸菌都可以被認為是益生菌[4]。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是益生菌的重要成員之一，已發現雙歧桿菌物種參與了多種促進健康的活性化合物的生物合成，包括短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）、維生素和有機酸[5]，其對宿主具有抗癌[6]和降低膽固醇水平等作用[7]。有研究表明，人類腸道中的雙歧桿菌可為人體提供能量、營養、調節免疫系統和調整宿主的腸道生理[8-11]。

雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性、非運動性和過氧化氫酶陰性的厭氧桿菌，其可以在人類腸道中存活。目前，在人類腸道中能夠存活和被發現的雙歧桿菌主要有長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、假長雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudomonas）和嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacterium thermophilum）等[12-14]。雙歧桿菌屬內不同的亞種或菌株具有不同的益生效果，如動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis），又稱乳雙歧桿菌，其具有較強的抗炎作用和抑制病原菌的作用，可以改善人體免疫系統[15]，已經被用作各種功能性食品中的活性成分[16-17]。然而，動物雙歧桿菌動物亞種卻不能夠在牛奶中生長[18]；長雙歧桿菌不同亞種能分泌不同的糖酵解酶[19]。因此，區分雙歧桿菌亞種是非常必要的。此外，在向消費者提供的益生菌產品標簽中標注明確到亞種或株的物種信息和其聲稱的產品益生效果也是至關重要的[20-21]。近些年，國外有研究報告顯示，商業益生菌產品存在標簽不準確的問題，比如缺少標注中明確的某些物種、標注物種分類信息不準確以及甚至出現了未申報物種被添加的情況[19，22]。然而，目前對于雙歧桿菌的檢測主要還是依靠傳統的生理生化方法，該方法已被證明不能對雙歧桿菌的不同種和亞種進行區分。因此，目前還沒有可靠的檢測方法來區分雙歧桿菌的不同種和亞種。

基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的方法已經被廣泛用于益生菌、乳制品、肉制品和海鮮制品中細菌菌株的鑒定[23-25]。特別是16S rRNA基因已被用作細菌鑒定的常用靶基因，該基因在屬間鑒定具有非常好的分辨率，然而在親緣關系非常近的物種間具有非常高的相似性（平均值＞95%），所以具有非常低的分辨率[26-27]。近些年，國外也有研究使用新的管家基因（如tuf基因[28]、recA基因[28]、hsp60基因[29]等）替代16S rRNA基因用于區分雙歧桿菌。這些基因與16S rRNA基因相比具有更高的分辨率，但是仍然無法區分相似性更高的物種和亞種。因此，這些基因只能應用于有限的物種區分[30]。

基于此，本研究通過生物信息學分析并建立系統發育樹，選擇區分度更高的基因建立一種能夠在亞種層面對動物雙歧桿菌乳亞種進行鑒定的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）方法。通過特異性、靈敏性和抗干擾實驗對該方法進行驗證，并對市售的64份標識含有乳雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉樣品進行檢測，以期為雙歧桿菌檢測標準的修訂提供參考，為動物雙歧桿菌桿菌乳亞種的鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

64份標識含有動物雙歧桿菌乳亞種的嬰幼兒配方乳粉樣品：北京市各大超市或銷售門店。

1.1.2 試劑及菌種

MRS瓊脂培養基、MC培養基：北京陸橋技術有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL）：天根生化科技有限公司；實驗所用菌株（表1）：中國工業微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

表1 實驗所用菌株信息Table 1 Information of strains used in the experiment

續表

1.2 儀器及設備

Taqman master mix、ABI QuantStudio 7實時熒光PCR儀：美國ABI公司；VITEKCompact微生物分析系統：法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及處理

將冷凍干燥保藏的動物雙歧桿菌乳亞種標準菌株轉接于MRS瓊脂培養基，37 ℃厭氧培養（48±2）h，轉接兩代回復活力，用于后續實驗。

1.3.2 DNA提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.3 引物探針設計

根據已發表文獻[26-30]確定選取16S-23S rRNA、Tuf、hsp60、recA、atpD等基因作為候選目標基因，在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站下載動物雙歧桿菌乳亞種及親緣關系較近的其他雙歧桿菌和乳桿菌的候選目標基因序列，使用DNAMAN V9.0軟件進行序列比對，以MEGA-X生物信息學軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，分析該基因在動物雙歧桿菌乳亞種水平的區分度，根據區分度確定目標基因。選擇目標基因的一段突變區序列作為引物和探針設計的目標片段。使用Primer Express V3.0設計引物和探針，設計得到的引物探針在NCBI網站進行primer Blast，選出特異性較好的引物探針由上海生物工程有限公司合成。引物探針序列見表2。

表2 實時熒光PCR引物和探針序列Table 2 Sequence of primers and probes of real-time fluorescence PCR

1.3.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR擴增體系（25 μL）：2×master mix 12.5μL、引物對（10μmol/L）各1 μL、探針（10μmol/L）0.5μL、模板DNA 1 μL、雙蒸水（ddH2O）9 μL。

實時熒光PCR擴增條件：50 ℃、2 min；95 ℃、10 min；95 ℃、5 s，64 ℃、40 s，40個循環；同時收集FAM熒光。

對照設置：陽性對照以動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC 1.2226 DNA為模板，陰性對照以大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922 DNA為模板；空白對照以雙蒸水為模板。

實時熒光定量PCR擴增曲線指數期明顯，Ct＜35可直接判定為陽性；Ct值為35～40判定為可疑，需要進行重復實驗；Ct＞40判定為陰性。

1.3.5 特異性及靈敏性試驗

特異性實驗以動物雙歧桿菌乳亞種及表1中的菌株DNA作為擴增模板，按照1.3.4中的方法進行實時熒光定量PCR擴增。

靈敏度實驗包括絕對靈敏度和相對靈敏度試驗[31]。絕對靈敏度試驗：測定動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226 DNA溶液的質量濃度，根據質量濃度梯度稀釋至10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.000 5 ng/μL、0.000 1 ng/μL。所有稀釋液在同一反應條件下進行實時熒光定量PCR擴增。相對靈敏度試驗：將稀釋后不同菌體濃度的動物雙歧桿菌乳亞種菌懸液添加到無菌嬰幼兒配方乳粉中，添加菌落數分別為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA后進行實時熒光定量PCR擴增。靈敏度實驗每個反應設置5個平行，重復實驗4次共20次實驗，記錄陽性擴增次數。

1.3.6 抗干擾試驗

為了驗證方法的抗干擾能力，設計基因組水平的抗干擾試驗和物種水平的抗干擾試驗。

基因組水平的抗干擾試驗：將提取得到的動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226的DNA稀釋至10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL，按照1∶1的體積比分別添加10 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922基因組DNA或TE緩沖液，混合后的DNA作為模板按照1.3.4的方法進行實時熒光定量PCR擴增，記錄干擾DNA對試驗結果的影響。

培養物水平的抗干擾試驗：將動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226培養物稀釋到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，按照1∶1的體積比分別添加107CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922或無菌水，充分混勻后取1 mL，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取DNA后進行實時熒光定量PCR擴增，記錄非特異性菌對實驗結果的影響。

1.3.7 市售嬰幼兒配方乳粉樣品的檢測

將購買得到的嬰幼兒配方乳粉樣品按照國標GB 4789.34—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》的方法進行培養。從每個樣品MRS平板上挑取10個單菌落，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，將該DNA作為模板進行實時熒光定量PCR擴增，記錄陽性擴增樣品數。

2 結果與分析

2.1 系統發育樹分析結果

基于NCBI網站下載的動物雙歧桿菌乳亞種及親緣關系較近的其他雙歧桿菌和乳桿菌的候選目標基因16S-23S rRNA、Tuf、hsp60、recA、atpD等的序列構建系統發育樹，結果發現，atpD基因具有較好的區分度，其系統發育樹見圖1。

圖1 基于atpD基因菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on atpD gene

由圖1可知，動物雙歧桿菌乳亞種和動物雙歧桿菌動物亞種雖然在同一個大的分支，但其差異率接近10%，與目前常用的菌種鑒定基因16S rRNA相比具有更大的分辨率[32]。atpD基因與乳桿菌和其他雙歧桿菌間的差異更為明顯，差異率＞10%。結果表明，atpD基因可以用于動物雙歧桿菌亞種間的鑒定和區分。

2.2 特異性驗證結果

實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的特異性驗證結果見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的特異性實驗結果Fig.2 Specificity test results of identification of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by real-time fluorescence quantitative PCR method

由圖2可知，以動物雙歧桿菌乳亞種的DNA為模板的實時熒光定量PCR具有明顯的熒光擴增曲線，以親緣關系較近的其他乳酸菌和食品中常見的細菌DNA為模板的實時熒光定量PCR均無熒光擴增信號。由此可以判斷，該引物探針可以特異性的擴增動物雙歧桿菌乳亞種atpD基因，并能夠與親緣關系較近的其他雙歧桿菌進行很好的區分。

2.3 靈敏性驗證實驗結果

2.3.1 絕對靈敏度驗證

實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的絕對靈敏度實驗結果見表3。

表3 實時熒光定量PCR法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的絕對靈敏度實驗結果Table 3 Absolute sensitivity test results of identification of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by real-time fluorescence quantitative PCR method

由表3可知，當動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226的DNA質量濃度為0.001 ng/μL時，20組試驗結果均為陽性；當DNA質量濃度為0.000 5 ng/μL時，出現陰性結果的情況，說明該方法在基因組水平的可穩定檢出的質量濃度為0.001 ng/μL，表示檢測下限可以達到1 pg/μL。因此，確定本研究建立的實時熒光定量PCR方法的絕對靈敏度為1pg/μL。

2.2.2 相對靈敏度驗證

實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的相對靈敏度實驗結果見表4。

表4 實時熒光PCR法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的相對靈敏度實驗結果Table 4 Relative sensitivity test results of identification of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by real-time fluorescence PCR method

由表4可知，當動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226的菌體濃度為103CFU/mL時，20組試驗結果均為陽性；當菌體濃度為102CFU/mL時，出現陰性結果的情況，說明本研究所建立的實時熒光定量PCR法從嬰幼兒配方乳粉中可穩定檢出的動物雙歧桿菌乳亞種最低菌體濃度為103CFU/mL。因此，確定本研究建立的實時熒光定量PCR法的相對靈敏度可以達到103CFU/mL。

2.3 抗干擾能力驗證實驗結果

2.3.1 基因組水平的抗干擾能力驗證

根據檢測過程的真實情況，往往檢測對象是多種雜菌與目標菌株共同存在的混合菌，導致提取得到的DNA不只是目標菌種一種基因組，因此，本實驗設計了基因組水平的抗干擾實驗，結果見表5。

表5 基因組水平實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的抗干擾實驗結果Table 5 Anti-disturbance test results of identification of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by real-time fluorescence quantitative PCR method at genome level

由表5可知，當動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226的DNA質量濃度分別為10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL時，Ct值均＜35，結果均為陽性，說明在干擾基因組DNA質量濃度是目標基因組質量濃度1 000倍的情況下，Ct值無顯著影響（P＞0.05）。結果表明，本研究建立的方法在基因組水平上具有非常好的抗干擾能力。

2.3.2 培養物水平的抗干擾實驗結果

培養物水平實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的抗干擾實驗結果見表6。

表6 培養物水平實時熒光定量PCR擴增法鑒定動物雙歧桿菌乳亞種的抗干擾實驗結果Table 6 Anti-disturbance test results of identification of Bifidobacterium animalis subsp. lactis by real-time fluorescence quantitative PCR method at culture level

由表6可知，當動物雙歧桿菌乳亞種CGMCC1.2226的菌體濃度分別為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL時，Ct值均＜35，結果均為陽性，說明在干擾菌體濃度是目標菌體濃度1 000倍的情況下，Ct值未有顯著影響（P＞0.05），均不影響動物雙歧桿菌乳亞種的檢出，結果表明，本研究建立的實時熒光定量PCR方法在培養物水平上具有很好的抗干擾能力。

2.4 市售嬰幼兒配方乳粉樣品的檢測結果

使用本研究建立的實時熒光定量PCR方法對市售的64份標明含有動物雙歧桿菌乳亞種的嬰幼兒配方乳粉進行檢測，檢測結果顯示均檢出動物雙歧桿菌乳亞種。從該結果可以反映出國內銷售的嬰幼兒配方乳粉添加動物雙歧桿菌乳亞種（乳雙歧桿菌）的添加種類及濃度均滿足國家標準GB10765—2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》[33]的要求。

3 討論

根據目前文獻報道，動物雙歧桿菌動物亞種和動物雙歧桿菌乳亞種在表型和基因型方面都具有非常高的相似性，但是它們又具有不同的功能，如它們在牛奶中的生長情況或表達酶的能力[18-19]。為了區分這些物種或亞種，目前認為可信度更高的方法是全基因組測序和實時熒光定量PCR方法。全基因組測序的方法雖然比較成熟，能夠更好的區分不同的種或亞種，但其鑒定成本過高，導致其在日常檢測中很難得到廣泛的應用。實時熒光定量PCR方法雖然是一種技術成熟、操作簡便、檢測成本較低的技術方法，但是建立一種能夠在種或亞種進行鑒定的實時熒光定量PCR方法也存在比較大的技術難度。根據目前的文獻報道，在雙歧桿菌屬或種水平的鑒定中選擇的目標基因主要是16S rRNA和Tuf基因，由于這兩個基因在亞種間具有非常高的相似度，因此很難用于亞種間的鑒定[34-35]。也有文獻報道[36]，通過比較基因組學分析的方法獲得功能基因，選用功能基因作為靶基因設計實時熒光定量PCR方法對長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌嬰兒亞種進行鑒定。但是該種方法具有一定的局限性，比如，長雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性唾液酸酶基因僅在一些長雙歧桿菌嬰兒亞種中存在，并不是所有長雙歧桿菌嬰兒亞種中都存在，該基因也被發現存在于一些兩歧雙歧桿菌中。此外，長雙歧桿菌長亞種特異性激酶基因，被證實在青春雙歧桿菌中也存在。因此，選擇功能基因作為目標基因建立的實時熒光定量PCR方法具有一定的局限性。為了能夠改善先前研究中存在分辨率低和局限性問題，通過大量的基因序列比對和發育樹的構建與分析，選取atpD基因作為目標基因設計引物探針。通過發育樹結果可以看出，動物雙歧桿菌乳亞種與動物雙歧桿菌動物亞種之間基因差異接近10%，與其他雙歧桿菌和乳桿菌差異率均＞10%，可以用于實時熒光定量PCR引物探針的設計。在此基礎上建立的實時熒光定量PCR方法具有非常好的特異性、靈敏性和抗干擾能力。

4 結論

本研究基于動物雙歧桿菌乳亞種、動物雙歧桿菌動物亞種、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧感覺、嬰兒雙歧桿菌和部分乳桿菌等22株菌的atpD基因建立系統發育樹，結果發現，該基因在雙歧桿菌乳亞種間具有較高的種間特異性，種間差異率＞10%，因此，利用該基因設計引物探針，利用實時熒光定量PCR法對動物雙歧桿菌乳亞種進行鑒定。結果發現，該方法能夠特異性的檢測動物雙歧桿菌乳亞種；絕對靈敏度可以達到1 pg/μL，相對靈敏度可以達到103CFU/mL；基因水平和培養物水平抗干擾能力良好。采用該方法從64份標識含有動物雙歧桿菌乳亞種的乳粉樣品均能檢測出動物雙歧桿菌乳亞種，表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能夠快速準確的對動物雙歧桿菌乳亞種進行檢測。本研究建立的實時熒光定量PCR法可為嬰幼兒配方乳粉中乳雙歧桿菌的檢測提供技術支撐，為其他雙歧桿菌的鑒定方法的建立提供了一定的數據參考。