微流控芯片環介導恒溫擴增技術快速檢測8種腸道致病菌*

宋 娜，劉朝陽，李夢藍，王玉飛，楊曉莉，孫振學

解放軍總醫院第三醫學中心檢驗科,北京 100039

腸道是致病菌定植和感染的主要器官[1]。腸道致病菌主要是通過污染的食物或水進入消化道，并最終定殖在腸道內引起感染性腹瀉等疾病[2]。據統計，全球每年有17～50億人發生腹瀉，140萬人因腹瀉死亡[3-5]。志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、彎曲菌、致瀉型大腸埃希菌是引起腹瀉的主要致病菌。因此，快速、準確、靈敏地檢測出致病菌，對腹瀉的臨床診斷及用藥有重要的指導意義。

微流控芯片環介導恒溫擴增技術(LAMP)是一種新興的分子診斷技術[6]，它將微流控芯片的微型化、高通量、低污染、低成本等優點與LAMP技術的簡便、快捷、高靈敏度等優點相結合[7]，集成了一個新型的診斷技術。本文分別以志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌的特異性目的片段設計引物，利用微流控芯片LAMP技術，在反應體系中加入熒光染料EvaGreen，在恒溫擴增過程中進行實時熒光監測，建立8種腸道致病菌同步檢測的微流控芯片LAMP檢測方法。現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株 實驗所用標準菌株購自北京陸橋技術股份有限公司。具體菌株信息見表1。

表1 實驗用菌株

1.2試劑與儀器 反應預混液(主要成分包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、EvaGreen)；細菌裂解液(北京熱景生物技術股份有限公司)；糞便提取試劑盒(北京熱景生物技術股份有限公司)；腸道致病菌微流控芯片(北京熱景生物技術股份有限公司)；微流控恒溫擴增PCR多重核酸檢測儀(北京熱景生物技術股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1引物設計與合成 本文使用的志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌基因組DNA引物均由北京熱景技術股份有限公司提供。

1.3.2模板DNA的制備 吸取1 mL含有實驗菌株的培養液，加入到1.5 mL無菌離心管中，10 000 r/min離心2 min，盡量棄除上清液；加入100 μL細菌裂解液懸浮菌體，95 ℃加熱5 min，上清液即為待檢測DNA模板。

1.3.3恒溫擴增反應體系配制 恒溫擴增反應體系為90 μL，包括10 μL待檢測DNA模板、45 μL反應預混液、35 μL DNase/RNase-Free去離子水。

1.3.4微流控芯片LAMP反應 將恒溫擴增反應體系加入腸道致病菌微流控芯片中，使用微流控恒溫擴增PCR多重核酸檢測儀進行恒溫擴增。以1×104CFU/mL的福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌混合菌液制備的基因組DNA為檢測靶標測試擴增效率，以高壓滅菌水作為反應條件特異性初篩模板，設置恒溫擴增溫度分別為60、63、65 ℃，反應時間30 min。

1.3.5微流控芯片LAMP特異度實驗 提取福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌、小腸結腸炎耶爾森菌、阪崎腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、長雙歧桿菌、干酪乳桿菌的基因組DNA，采用1.3.3和1.3.4的反應體系和擴增方法進行擴增，以此來驗證各個檢測引物的特異性是否滿足檢測要求。

1.3.6微流控芯片LAMP靈敏度實驗 用無菌生理鹽水分別將福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌的菌液稀釋至1×106、1×105、1×104、 1×103、1×102CFU/mL，并進行平板菌落計數。然后再將上述菌液混合稀釋至1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL系列濃度，并分別對混合菌液的每個梯度進行模板DNA的制備，采用1.3.3和1.3.4的反應體系和擴增方法進行檢測。

1.3.7模擬樣本的檢測 將福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸埃希菌的菌液混合，稀釋至終濃度分別為1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合致病菌菌液。取不同濃度的混合致病菌菌液1 mL分別加入黃豆粒大小的健康人糞便(約2.3 g)中，使用菌液將糞便懸浮混勻，4 ℃放置過夜，使細菌與糞便充分吸附，即為制備的模擬污染糞便樣本。每個濃度制備3份模擬污染糞便樣本，共制備15份，同時制備3份只加滅菌純化水的未被污染的模擬糞便樣本作為陰性對照。使用糞便提取試劑盒提取模擬糞便樣本DNA，采用1.3.3和1.3.4的反應體系和擴增方法進行檢測。

2 結 果

2.1反應溫度優化 在恒溫擴增反應體系中，溫度不僅影響著擴增效率還直接關系著體系的特異性。溫度高時特異性強，但引物不能與模板牢固結合，擴增效率下降；溫度低時產量高，但可能造成引物與模板錯配，產生非特異性產物。因此，在保證特異性的前提下為了提高擴增效率，需要對恒溫擴增反應體系進行溫度優化，以選取最佳的反應條件。綜合8種腸道致病菌，在65 ℃條件下，擴增效率最佳，檢出時間(CT)最短，且無非特異擴增產物。這表明在相同的時間內，恒溫擴增反應體系在65 ℃條件下有著更多的特異性產物，更有利于檢測。見表2。

表2 反應溫度優化結果(min)

2.2微流控芯片LAMP特異性分析 本研究分別將1.3.5提取的各菌液基因組DNA作為檢測模板，配制成恒溫擴增反應體系并加入腸道致病菌微流控芯片中進行恒溫擴增，結果顯示，福氏志賀菌的基因組DNA在反應孔2和10中顯示陽性，在其他反應孔中均為陰性；鼠傷寒沙門菌的基因組DNA在反應孔3和10中顯示陽性，在其他反應孔中均為陰性；副溶血性弧菌的基因組DNA在反應孔4和10中顯示陽性，在其他反應孔中均為陰性；空腸彎曲菌的基因組DNA在反應孔5和10中顯示陽性，在其他反應孔中均為陰性；大腸埃希菌的基因組DNA在反應孔6～10顯示陽性，在其他反應孔中均為陰性；小腸結腸炎耶爾森菌的基因組DNA、阪崎腸桿菌的基因組DNA、單核細胞增生李斯特菌的基因組DNA、金黃色葡萄球菌的基因組DNA、銅綠假單胞菌的基因組DNA、肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA、糞腸球菌的基因組DNA、長雙歧桿菌的基因組DNA、干酪乳桿菌的基因組DNA，均只有反應孔10顯示陽性，在其他反應孔中全部為陰性。以上結果說明8項致病菌的反應體系均未與其他細菌出現交叉反應，特異性好，同時也說明芯片的密閉性良好，各反應孔之間獨立，無交叉反應。說明建立的8種腸道致病菌微流控芯片LAMP能夠為臨床診斷提供可靠依據。

2.3微流控芯片LAMP靈敏度分析 為驗證LAMP對8種腸道致病菌的靈敏度，將提取的1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合菌液基因組DNA進行微流控芯片LAMP擴增。結果顯示，混合菌液濃度在1×102CFU/mL及以上時8種致病菌的熒光值均逐漸增強直至擴增完成，發生擴增反應，即該方法對福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌的最低檢測限均為100 CFU/mL；并且隨著混合菌液濃度的降低，引物與模板接觸的可能性減少，導致反應所需時間變長；當混合菌液濃度為1×101CFU/mL時，因濃度太低與引物結合失敗而無法完成擴增反應。

2.4模擬糞便樣本檢測 模擬糞便樣本中各致病菌的濃度分別為 1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、0 CFU/mL，提取基因組DNA后檢測。本實驗建立的微流控芯片LAMP對模擬糞便樣本中福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產毒素大腸埃希菌的最低檢出限為100 CFU/mL；對空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，同時對滅菌純化水處理的糞便未檢出上述致病菌。對模擬糞便的檢測結果表明，微流控芯片LAMP能夠成功檢測糞便中的致病菌，且與對菌液的檢測時間一致，最快可在10 min內獲得陽性判定結果，而對于最低檢出限濃度的糞便樣本，在30 min內獲得陽性判定結果，整個過程不超過30 min。見表3。

表3 不同濃度模擬糞便樣本中各致病菌CT檢測結果(min)

3 討 論

無論在發達國家還是發展中國家，急性腹瀉仍然是一個嚴重的公共衛生問題[8]。志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌是腸道感染的常見致病菌，能夠經過消化道傳播，引起局部暴發流行[9-10]。所以，亟需一種快速、準確、靈敏、便捷的檢測手段，用于檢測糞便樣本中的腸道致病菌群，預防疾病流行，并有效指導抗菌藥物的使用。

本研究通過優化傳統的LAMP檢測方法，建立多通道微流控芯片LAMP，并采用對擴增反應抑制較小的EvaGreen熒光染料來進行實時熒光監測，實現了8種重要腸道病原體快速、特異、靈敏和一體化檢測。檢測結果顯示，志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌共8種致病菌可通過同一張芯片同時檢測。所需試劑量少，且微流控芯片LAMP無須進行變性、退火、延伸等復雜步驟即可實現擴增，與實時熒光定量PCR方法需要昂貴、精密實驗儀器相比，反應成本低。同時，微流控芯片LAMP技術，靈敏度較高，芯片中8種致病菌的檢測靈敏度均為100 CFU/mL，比傳統LAMP方法靈敏度高出10倍左右[11]。在模擬糞便樣本中，福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌的最低檢出限均為100 CFU/mL，空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，優于多重PCR檢測方法[12-13]。此外，這8種致病菌的擴增檢測可以在30 min之內判定結果，比大部分相同靈敏度水平的分子生物學快速檢測方法用時短[14-15]。

本研究針對志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌的保守基因分別設計了一套特異性引物，使其適合于該8種致病菌的核酸診斷。此外，微流控芯片LAMP實現了全封閉操作，避免了氣溶膠的污染[16-17]。同時，在微流控芯片上還設置了內參對照，可以監控實驗過程是否正常，實現了擴增反應體系的全封閉化和微量化，從而避免了人員操作造成的人為實驗污染，大大提高了檢測的準確性和特異度[12,18-19]。

綜上所述，針對志賀菌、沙門菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、腸聚集性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸道致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌設計引物并建立微流控芯片LAMP，可應用于糞便樣本檢測。8種致病菌均能在30 min內獲得陽性判定結果，且檢測靈敏度可達100 CFU/mL。模擬糞便樣本中福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌、產腸毒素大腸埃希菌的最低檢測限可達100 CFU/mL；空腸彎曲菌和腸聚集性大腸埃希菌的最低檢出限為1 000 CFU/mL，說明微流控芯片LAMP具有用時短、反應快、特異度和靈敏度高且操作簡單等特點，從而使病原微生物床旁檢測(POCT)成為可能。