血清1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺、5,6-二氫胸腺嘧啶、膽綠素水平與哮喘兒童肺功能的相關(guān)性*

張稱心，李琳琳，張艷波

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

哮喘是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，各年齡段人群均有發(fā)病，其特征是氣喘、胸悶、呼吸短促和咳嗽的發(fā)作[1]。根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心2016年的報(bào)告，5～11歲和12～17歲兒童的哮喘患病率分別為9.6%和10.5%[2]。在中國(guó)，哮喘是兒童中常見(jiàn)的慢性疾病，給家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[3]。許多物質(zhì)已經(jīng)被確定為哮喘的影響因素，但這些物質(zhì)如何影響疾病仍不清楚[4]。代謝組學(xué)是對(duì)生物系統(tǒng)中所有代謝物(包括碳水化合物、肽、氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸和脂類)進(jìn)行系統(tǒng)分析的學(xué)科，它已成為診斷疾病新生物標(biāo)志物的有效工具，并可能幫助識(shí)別與復(fù)雜疾病相關(guān)的新途徑[5]。與轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后的變化相比，代謝物可能是更準(zhǔn)確的疾病標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈兯降淖兓砹艘环N整合的病理生理學(xué)特征，是遺傳和環(huán)境相互作用的結(jié)果[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘兒童血清中1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺(2PY)、5,6-二氫胸腺嘧啶(DHT)、膽綠素(BV)水平異常[7]，但是這種異常是否與肺功能相關(guān)仍然未知。基于此，本研究探討哮喘兒童血清2PY、DHT、BV水平與肺功能的關(guān)系，以及3種指標(biāo)對(duì)哮喘的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年11月至2021年4月本院收治的哮喘兒童100例為哮喘組，選擇同時(shí)期體檢的健康兒童100例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)哮喘患兒符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[8]。具體表現(xiàn)如下：①多于每月1次的頻繁發(fā)作性喘息；②活動(dòng)誘發(fā)的咳嗽或喘息；③非病毒感染導(dǎo)致的間歇性夜間咳嗽；④喘息癥狀持續(xù)至3歲以后；⑤抗哮喘治療有效，但停藥后又復(fù)發(fā)。(2)哮喘患兒家屬知情同意并簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)早產(chǎn)兒；(2)無(wú)法配合完成本研究檢測(cè)者；(3)先天性呼吸道疾病者。對(duì)照組與哮喘組一般資料的比較見(jiàn)表1，兩組性別比例、年齡和母乳喂養(yǎng)比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有家族過(guò)敏史比例、用力肺活量(FVC)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05)。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法 入院時(shí)檢測(cè)兩組受試者的FVC、第1秒用力呼氣容積(FEV1)、75%呼氣中期流量(MEF75%)、50%呼氣中期流量(MEF50%)、25%呼氣中期流量(MEF25%)和最大呼氣流量(PEF)。采集哮喘組入院時(shí)治療前及對(duì)照組體檢時(shí)的肘前靜脈血4 mL后分離血清。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品2PY(RH125152，BIORULER)、DHT(T0532，TOPSCIENCE)、BV(RH106781，BIORULER)使用質(zhì)譜檢測(cè)血清中各指標(biāo)水平。質(zhì)譜檢測(cè)的主要步驟如下：將100 μL的樣品與100 μL水和800 μL甲醇混合，并在-20 ℃下孵育10 min脫蛋白。以 13 000×g離心10 min后，將脫蛋白的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的塑料離心管中。使用真空 SpeedVac 蒸發(fā)器在45 ℃下蒸發(fā)溶劑3 h。將干燥的殘留物溶解在100 μL 95%乙腈中，并加入 0.1%甲酸。然后使用Bandelin RM 40UH 清洗機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理5次，每次持續(xù)30 s，以更好地溶解殘留物。然后將樣品以13 000×g離心10 min，所得上清液用于質(zhì)譜分析。使用配備電噴霧電離源的 MicroTOF-Q 混合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜儀設(shè)置為優(yōu)先檢測(cè)質(zhì)荷比(m/z)為50～1 000的離子，質(zhì)量準(zhǔn)確度為 (2～4)ppm。在正負(fù)離子電荷檢測(cè)模式下記錄光譜。使用連接到注射泵的玻璃注射器將樣品注入電噴霧電離源。樣品到電離源的流速為180 μL/h，樣品以隨機(jī)順序注射。使用DataAnalysis 程序從質(zhì)譜峰確定離子代謝物的質(zhì)量。選擇所有高于噪音水平的峰值。如果兩個(gè)峰的相對(duì)分子質(zhì)量差異不超過(guò)0.01，則認(rèn)為兩個(gè)峰與同一代謝物相關(guān)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)的二元矩陣用于進(jìn)一步分析。使用Matlab v.12程序進(jìn)行質(zhì)譜處理。

2 結(jié) 果

2.1哮喘組和對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較 哮喘組FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 哮喘組和對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較

2.2哮喘組和對(duì)照組血清2PY、DHT、BV水平比較 哮喘組血清2PY、DHT、BV水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 哮喘組和對(duì)照組血清2PY、DHT、BV水平比較

2.3血清2PY、DHT、BV水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 采用Pearson相關(guān)對(duì)2PY、DHT、BV水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2PY、DHT、BV水平與FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 血清2PY、DHT、BV水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性(r)

2.4影響兒童哮喘發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 以是否發(fā)生兒童哮喘為因變量(是=1，否=0)，以年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、2PY、DHT、BV水平、嬰幼兒期使用抗菌藥物、母乳喂養(yǎng)、有家族過(guò)敏史為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，2PY高水平兒童的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是低水平的8.145倍，DHT高水平兒童的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是低水平的7.258倍，BV高水平兒童的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是低水平的8.617倍，嬰幼兒期使用抗菌藥物的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未使用的2.477倍，有家族過(guò)敏史的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)家族過(guò)敏史的3.405倍，而年齡、性別、BMI、母乳喂養(yǎng)并不是兒童哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，見(jiàn)表5。

表5 影響兒童哮喘發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

2.5血清2PY、DHT、BV水平對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，2PY診斷兒童哮喘的曲線下面積(AUC)為0.94(95%CI： 0.915 2～0.990 4)；DHT診斷兒童哮喘的AUC為0.93(95%CI：0.920 4～0.973 5)；BV診斷兒童哮喘的AUC為0.95(95%CI：0.921 7～0.989 4)。見(jiàn)表6。

表6 血清中2PY、DHT、BV水平診斷兒童哮喘的價(jià)值分析

3 討 論

本研究通過(guò)檢測(cè)血清2PY、DHT、BV水平與肺功能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)2PY、DHT、BV水平與FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，并且2PY、DHT、BV高水平是兒童哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。血清2PY、DHT、BV診斷兒童哮喘的靈敏度分別為92.0%、89.0%、97.0%，特異度分別為94.0%、90.0%、91.0%。提示血清2PY、DHT、BV水平可作為診斷兒童哮喘的潛在標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組中煙酰胺途徑代謝產(chǎn)物2PY水平高于對(duì)照組(P<0.05)。相關(guān)研究顯示，煙酸和煙酰胺代謝途徑與哮喘表型有關(guān)[9]。一項(xiàng)對(duì)人類氣道平滑肌的體外研究表明，來(lái)自哮喘供體的細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二磷酸(NADPH)氧化酶的表達(dá)增加，從而促進(jìn)氧化應(yīng)激和平滑肌細(xì)胞的收縮[10]。另有研究結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞性哮喘患者NADPH氧化酶表達(dá)增加，同時(shí)支氣管上皮纖毛功能降低[11]。這些體外模型為本研究觀察到的血漿煙酰胺代謝物與當(dāng)前哮喘之間的關(guān)系提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組血清BV水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。BV是哮喘兒童中產(chǎn)生的一種代謝物，是膽汁的成分之一[12]。相關(guān)研究表明，血紅素加氧酶(血紅素中產(chǎn)生BV的酶)的活性可能會(huì)對(duì)呼吸道的黏液分泌產(chǎn)生影響[13]。對(duì)健康人支氣管上皮細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，血紅素加氧酶的過(guò)表達(dá)與白細(xì)胞介素(IL)-13誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞減少和黏蛋白MUCA5分泌減少有關(guān)[14]。哮喘患者血清BV水平的降低可能反映血紅素加氧酶的活性降低，這可能有助于氣道黏液分泌的增加。

與對(duì)照組相比，哮喘組血清DHT水平升高提示哮喘患兒的嘧啶代謝可能發(fā)生改變，這可能與哮喘的病理生理學(xué)有關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)哮喘患兒的大型代謝組學(xué)研究表明，嘧啶代謝物與哮喘的3個(gè)表型(甲膽堿反應(yīng)性、支氣管擴(kuò)張劑使用前FEV1/FVC和支氣管擴(kuò)張劑使用后FEV1/FVC)之間存在關(guān)聯(lián)[15]。然而，嘧啶代謝與影響哮喘的生理過(guò)程之間的聯(lián)系尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒期使用抗菌藥物其哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是未使用的2.477倍，有家族過(guò)敏史的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)家族過(guò)敏史的3.405倍。過(guò)敏可能是兒童哮喘發(fā)生的一個(gè)重要因素，因?yàn)榕c輕度哮喘患兒相比，患有更嚴(yán)重哮喘患兒更具有特應(yīng)性，并且往往暴露于更高水平的過(guò)敏原中[16]。家族過(guò)敏史是兒童哮喘的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，越來(lái)越多的證據(jù)表明過(guò)敏具有遺傳風(fēng)險(xiǎn)[17]。因此，遺傳因素確實(shí)在兒童哮喘風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮重要作用，兒童哮喘與遺傳關(guān)系密切。

綜上所述，血清2PY、DHT、BV水平與肺功能具有相關(guān)性，其可作為診斷兒童哮喘的潛在標(biāo)志物。