HMMR預測肝細胞癌預后的生物信息學分析*

吳良銀，李文麗，劉 俊

粵北人民醫院：1.檢驗科；2.生殖醫學中心，廣東韶關 512025；3.汕頭大學醫學院，廣東汕頭 515041

肝細胞癌是世界上第五大常見惡性腫瘤，每年全球確診的新病例超過70萬[1]。雖然目前采取了包括一級預防策略、早期篩查診斷以及更先進治療技術在內的多種診療方案，但肝癌的總體發病率和病死率仍持續上升[2]。肝細胞癌是一種高異質性腫瘤，且肝細胞癌的發生和發展是多機制調控、多分子參與的過程[3]。目前，肝細胞癌仍面臨著高復發率及晚期低生存率的現狀，因此，準確地識別預后生物標志物對預后較差的高危患者進行監測和制訂個體化治療策略，以及防止復發都具有重要的意義。

越來越多的證據表明，分子遺傳及拷貝數變異在肝細胞癌的發生、發展中起著重要的作用。隆紹平等[4]研究結果表明，非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)是預測肝細胞癌患者預后的因素，可能成為肝細胞癌預后的重要生物標志物[4]。相關研究顯示，透明質酸介導的運動受體(HMMR)在肝細胞癌中呈顯著高表達，并且有一定的預后意義，但其在肝細胞癌中的作用仍有待進一步研究[5]。本研究回顧性分析了癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)和國際癌癥基因組聯合體(ICGC)數據庫中的肝細胞癌轉錄組數據和相對應的臨床資料，旨在分析HMMR在肝細胞癌中的表達情況，以及與臨床分期的相關性，同時通過單因素生存分析以及多因素COX回歸分析HMMR對肝細胞癌預后的預測作用?，F報道如下。

1 資料和方法

1.1一般資料 從TCGA數據庫下載377例肝細胞癌患者的表達譜數據和臨床資料，同時從ICGC數據庫下載232例肝細胞癌患者的表達譜數據和臨床資料。選取癌旁組織202例、正常組織202例進行比較。609例肝細胞癌患者中男426例，女183例；生存438例，死亡171例；TNM分期T1、T2、T3、T4分別有185、95、80、13例，M0、M1、MX各有272、4、101例，N0、N1、NX各有257、4、115例；Stage分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各有211、193、157、24例；組織學分級G1、G2、G3、G4級各有55、180、124、13例。

1.2基因富集分析(GSEA) 為了進一步探索HMMR的表達對于肝細胞癌的潛在影響機制，本研究通過GSEA分析來闡明HMMR高低表達組之間差異基因的富集通路。從GSEA官網 (http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下載GSEA (JAVA version,2-2.2.3) 分析軟件。GSEA通過標準化的P值和標準化的富集評分來分析富集通路。

1.3統計學處理 使用R3.6.1統計軟件進行統計學分析。計數資料采用百分數表示。采用Wilcoxon秩和檢驗比較HMMR的表達水平在肝細胞癌和正常組織之間以及肝細胞癌和癌旁組織之間的差異。采用Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和Logistic回歸分析臨床特征與HMMR表達水平之間的關系。采用Kaplan-Meier法分析HMMR的表達水平與患者總體生存時間的關系。采用單因素及多因素COX回歸分析比較HMMR的表達水平對生存期及其他臨床特征的影響。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HMMR在肝細胞癌組織、正常組織、癌旁組織中的表達水平比較 結果顯示，與正常組織比較，HMMR在肝細胞癌組織中表達水平顯著升高(P<0.05)。同時，與癌旁組織比較，HMMR在肝細胞癌組織中表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

注：A為HMMR在正常組織和肝細胞癌組織中表達水平的比較；B為HMMR在癌旁組織和肝細胞癌組織中的表達水平比較。圖1 HMMR在肝細胞癌組織、正常組織、癌旁組織中的表達情況

2.2HMMR在肝細胞癌中的表達水平與臨床特征的相關性 本研究分析了TCGA數據庫中 HMMR的表達水平與臨床特征的關系，結果顯示，組織學分級越高，HMMR表達水平越高(P<0.05)；Stage分期、T分期越高，HMMR表達水平也更高(P<0.05)。而不同M分期及N分期的患者HMMR表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。同時，Logistic回歸分析顯示，StageⅡ期和StageⅢ期的HMMR表達水平高于StageⅠ期(OR=2.49、2.57；P=0.000 7、0.000 5)；T2及T3期的HMMR表達水平高于T1期(OR=2.73、2.31；P=0.000 1、0.002 2)；同時，G3期的HMMR表達水平高于G1期(OR=2.92，P=0.001 5)。Kaplan-Meier曲線分析結果顯示，HMMR低表達患者生存率高于HMMR高表達者，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖2。同時，本研究分析了ICGC數據庫中HMMR在肝細胞癌組織、正常組織中的表達水平，結果顯示，HMMR在肝細胞癌組織中表達水平顯著升高(P<0.001)；Kaplan-Meier生存分析也表明，HMMR高表達患者在ICGC數據庫中的生存率低于HMMR低表達者(P<0.001)。見圖3。

注：A為HMMR表達水平與組織學分級的關系分析；B為HMMR表達水平與腫瘤Stage分期的關系分析；C為HMMR表達水平與T分期的關系分析；D為HMMR表達水平與M分期的關系分析；E為HMMR表達水平與N分期的關系分析；F為不同HMMR表達水平的患者生存率分析。圖2 HMMR在肝細胞癌中的表達與臨床特征的關系

2.3HMMR是肝細胞癌的獨立預后因子 本研究采用單因素及多因素COX回歸分析HMMR對預后的預測價值。單因素回歸分析結果顯示，TCGA和ICGC數據庫中HMMR高表達是預后不良的危險因素(HR=1.15、1.19；P<0.001)。多因素回歸分析結果顯示，TCGA和ICGC數據庫中HMMR高表達是預后不良的危險因素(HR=1.80、2.56，P<0.001)。

2.4GSEA 采用GSEA方法，共發現12條通路富集在HMMR高表達患者中，包括RNA 降解、DNA復制、P53信號通路、癌癥通路、凋亡通路等，見表1。

表1 HMMR的高、低表達數據集與肝細胞癌發生發展相關的信號通路

續表1 HMMR的高、低表達數據集與肝細胞癌發生發展相關的信號通路

3 討 論

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，患者的預后一般較差，在全球癌癥相關死亡的主要原因中排名第二[6]。雖然肝細胞癌的治療在過去幾十年里取得了快速的發展，包括從手術和局部治療到分子靶向治療以及免疫治療等，但預后情況一直不樂觀[7]。因此，闡明肝細胞癌發生、發展的分子機制，以及發現新的治療靶點，完善治療方案勢在必行。

隨著高通量測序技術的發展，近年來越來越多的研究者運用高通量方法來探索與疾病發生和預后相關的潛在分子標志物[8-9]。毛麗萍等[10]的研究表明，血漿Dickkopf同源物1(DKK1)對肝細胞癌的診斷有一定價值，并可作為甲胎蛋白(AFP)的有效補充。HAN等[11]在3個獨立的數據集中驗證了SAC3D1在腫瘤組織異常高表達，并且通過生存分析及多因素分析表明其是肝細胞癌的獨立預后因子。LIANG等[12]在兩個獨立的數據集中通過單因素COX回歸及最小絕對收縮和選擇算法構建了10個基因的預測模型，用于肝細胞癌患者的預后評估。本研究從TCGA和ICGC數據庫中獲得609例患者的信息來評估HMMR在肝細胞癌中的預后價值，在TCGA和ICGC數據庫中，HMMR表達水平在肝細胞癌晚期上升，提示較高的HMMR水平對肝細胞癌的進展有不利影響，并且單因素和多因素COX回歸分析表明，HMMR是肝細胞癌的獨立預后因子。

有研究表明，HMMR編碼的蛋白質是透明質酸介導的運動受體，當透明質酸與HMMR結合時，包括PTK2/FAK1在內的許多蛋白質就會發生磷酸化，HMMR與腫瘤的發生過程相關，是多種腫瘤的易感基因，其在腫瘤進展中的作用通常歸因于透明質酸介導的信號傳導[13]。HMMR也可能參與細胞轉化和轉移的形成，以及調節細胞外調節激酶(ERK)的活性。YANG等[14]研究結果表明HMMR可能調控膀胱癌的多個通路，并且其在腫瘤組織中的異常高表達是膀胱癌的無病生存期的特異性預后標志物。本課題組前期結果也表明HMMR在肝細胞癌的發生、發展中具有一定作用，并對預后有影響[5]。

已有研究顯示，P53信號通路在維持基因組穩定性和保真度上扮演著重要角色，并且影響著細胞的代謝和衰老，在多種腫瘤的發生和發展中都起著非常重要的作用[15]。Wnt 信號通路是胚胎發育過程中的關鍵傳導通路，并且在調節組織穩態方面也起著重要作用，Wnt 信號通路的異常激活與許多腫瘤的發生相關[16]。本研究通過GSEA分析表明在HMMR高表達患者中，P53信號通路、Wnt信號通路、DNA復制及細胞凋亡通路被顯著富集。這些結果說明HMMR可能在肝細胞癌的P53及Wnt信號通路激活中起著重要作用。

綜上所述，本研究結果顯示，HMMR在肝細胞癌腫瘤組織中顯著高表達，且其表達水平與肝細胞癌的疾病進展相關。此外，HMMR在肝細胞癌腫瘤組織中表達水平越高，其預后越差，且HMMR可以獨立于其他臨床因素作為肝細胞癌的預后因子。