血清外泌體miR-21靶向PTEN激活PI3K/AKT信號通路誘導肺癌細胞的生長和轉移的機制分析*

張 茜，同立宏，馬紅霞

新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆烏魯木齊 830002

肺癌是常見且病死率較高的惡性腫瘤，其發病率位居惡性腫瘤之首，根據病理特征可將其分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，肺癌的治療除了傳統的手術和放化療外，一些針對經典腫瘤靶點的藥物及針對免疫檢查點類藥物的成功研發均為肺癌的治療提供了幫助，但是肺癌患者5年生存率仍然較低，約為15%[1-3]，因此探討肺癌發生機制，研究新型治療手段對于肺癌患者至關重要。腫瘤外泌體是一類由腫瘤細胞分泌的納米級囊泡，可存在于血液、唾液、淚液等體液中，外泌體內含多種遺傳物質，包括微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、DNA、環狀RNA(circRNA)等，其中血清外泌體中miRNA與腫瘤的病理機制密切相關，并且具有用于腫瘤診斷和治療的潛力[4-5]。有研究顯示，miR-21在肺癌中高表達[6]，亦有學者報道，miR-21可誘導腫瘤相關成纖維細胞的形成而促進肺癌的發展[7]，亦可調控蛋白激酶B(AKT)/磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)/半胱氨酸蛋白酶3/基質金屬蛋白酶(MMP)-2/MMP-9信號通路而促進肺癌的生長和轉移[8]。本文探討了血清外泌體中miR-21的表達水平，以及對肺癌細胞生長和轉移的影響及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集20例肺癌患者的血液標本以及18例健康志愿者血液標本。肺癌患者納入標準：經活檢標本病理檢查確診為肺癌、未接受過手術、化療、放療等治療，本研究獲得本院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。人肺癌細胞A549(中國科學院上海細胞庫)；Transwell小室(購自美國Corning公司)；CCK8試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)；蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)、磷酸化磷酸酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、PI3K、p-AKT、AKT、CD9、CD63、TSG101、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，雙熒光素酶報告基因試驗檢測試劑盒(英國Abcam公司)，Trans ExoTM Serum/Plasma Exosome Kit(北京全式金科技有限公司)，ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德國QIAGEN公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 A549細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-21組(轉染miR-21 mimic)和miR-21+PTEN組(轉染miR-21 mimic后再轉染PTEN質粒)，Normal exo組(A549細胞與10 μg/mL Normal exo共孵育48 h)、LCA exo組(A549細胞與10 μg/mL LCA exo共孵育48 h)、LCA exo+PTEN組(A549細胞與10 μg/mL LCA exo共孵育48 h后轉染PTEN質粒)、PBS組(A549細胞中加入等體積PBS培養48 h)。按照上述分組，使用Lipofectamine 2000試劑進行轉染。

1.2.2外泌體提取與鑒定 將20例肺癌患者的血液標本及18例健康志愿者血液標本置于無菌試管中，放置30 min取上層血清，血清外泌體提取使用TransExoTMSerum/Plasma Exosome Kit試劑盒。在透射電鏡下觀察外泌體的結構，Western blot鑒定外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101。

1.2.3qRT-PCR 使用ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血清外泌體miRNA，使用miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒和EvaGreen miRNA qRCR MasterMix試劑盒進行miR-21逆轉錄反應和qRT-RCR反應，使用2-ΔΔCT法計算miR-21表達。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.4雙熒光素酶報告基因試驗 TargetScan數據庫預測miR-21與PTEN結合位點，構建PTEN野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質粒(pGL3- PTEN MUT組)及空白質粒(pGL3-control組)，并使用Lipofectamine 2000轉染試劑將上述質粒轉染進293T細胞，再用RNA轉染試劑將miR-21 mimic和miR-NC轉染至上述293T細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.2.5CCK8法檢測細胞增殖能力 將轉染后或者與外泌體孵育后的各組A549細胞接種至96孔板，每孔1 000個/100微升，于細胞培養箱中培養0、24、48、72 h后，取出對應的96孔板，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于細胞培養箱中孵育4 h后，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值(A值)。

1.2.6Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力 取各組A549細胞用RPMI-1640空白培養基稀釋，然后以10 000個/200微升接種至Transwell小室中(或鋪Matrigel膠的Transwell小室)，小室置于600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640的24孔板中，然后轉移至細胞培養箱中72 h，取出后用PBS清洗小室，底部滴加無水甲醛固定30 min，底部滴加結晶紫溶液染色10 min，清洗小室，晾干，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7Western blot檢測PTEN蛋白表達 取各組A549細胞1×104個加入200 μL RIPA冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心15 min，取上清液為細胞總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，取10 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉膜，封閉2 h，PVDF膜與PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、CD9、CD63、TSG101抗體4 ℃過夜孵育，TBST洗膜后，二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結 果

2.1外泌體的鑒定結果 透射電鏡觀察到Normal exo組和LCA exo組外泌體粒徑在30～100 nm，具有雙層膜結構，呈“杯托”樣，并且表達外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101。見圖1、圖2。

圖1 透射電鏡鑒定外泌體

圖2 Western blot鑒定外泌體

2.2肺癌患者血清外泌體中miR-21高表達 qRT-PCR檢測結果顯示，與Normal exo組比較，LCA exo組中miR-21表達上調(P<0.001)。見圖3。

注：***P<0.001。圖3 qRT-PCR檢測Normal exo組和LCA exo組中miR-21的表達

2.3PTEN為miR-21的靶基因 雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，pGL3-PTEN WT組293T細胞轉染miR-21 mimic后相對熒光強度低于轉染miR-NC的細胞(P<0.001)，而pGL3-PTEN MUT組293T細胞轉染miR-NC和miR-21 mimic后相對熒光強度無明顯變化。Western blot檢測結果顯示，相比于miR-NC組，miR-21組A549細胞PTEN表達水平下調(P<0.001)。見圖4。

注：A為數據庫預測miR-21和PTEN mRNA的靶向結合位點；B為雙熒光素酶報告基因試驗；C為Western blot檢測miR-21對PTEN蛋白表達的影響；與miR-NC組比較，***P<0.001。圖4 miR-21靶向抑制PTEN表達

2.4miR-21靶向PTEN促進肺癌細胞的生長和轉移能力 CCK8、細胞遷移和侵襲檢測結果顯示，相比于miR-NC組，miR-21組A549細胞在24、48、72 h的A值顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數顯著增加(P<0.001)；相比于miR-21組，miR-21+PTEN組細胞在48、72 h的A值顯著下降(P<0.01)，細胞遷移和侵襲數顯著減少(P<0.001)。見圖5。

注：A為3組細胞在不同時間點的A值變化情況；B為顯微鏡觀察3組細胞遷移和侵襲情況(×20)；C為3組細胞遷移和侵襲數的比較。與miR-NC組比較，***P<0.001；與miR-21組比較，###P<0.001。圖5 miR-21靶向PTEN抑制肺癌細胞生長和轉移能力

2.5肺癌患者血清外泌體轉移miR-21至肺癌細胞情況 qRT-PCR檢測結果顯示，相比于PBS組，LCA exo組A549細胞中miR-21表達水平顯著上調(P<0.001)，而Normal exo組A549細胞中miR-21表達水平與PBS組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，說明肺癌患者血清外泌體可轉移miR-21至肺癌細胞中。見圖6。

注：與PBS組比較，***P<0.001。圖6 qRT-PCR檢測各組A549細胞中miR-21表達

2.6血清外泌體傳遞miR-21調控PTEN表達而促進肺癌的生長和轉移能力 CCK8、Transwell及Western blot檢測結果顯示，與PBS組比較，LCA exo組A549細胞A值在24、48、72 h顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數顯著增加(P<0.001)，PTEN表達水平顯著下調(P<0.001)，而Normal exo組細胞增殖、遷移、侵襲能力及PTEN表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。LCA exo+PTEN組A549細胞PTEN表達上調(P<0.001)，A值在24、48、72 h顯著低于LCA exo組(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數顯著低于LCA exo組(P<0.001)，說明血清外泌體miR-21調控PTEN表達而促進肺癌的生長和轉移。見圖7。

注：A為Western blot檢測4組細胞PTEN表達情況；B為4組細胞PTEN相對表達水平的比較；C為4組細胞在不同時間點的A值變化情況；D為顯微鏡觀察4組細胞遷移和侵襲情況(×20)；E為4組細胞遷移和侵襲數的比較;與PBS組比較，***P<0.001；與LCA exo組比較，###P<0.001。圖7 LCA exo可抑制PTEN表達而促進肺癌細胞的生長和轉移

2.7血清外泌體傳遞miR-21靶向PTEN而激活PI3K/AKT信號通路 與PBS組比較，LCA exo組A549細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著增加(P<0.001)，而Normal exo組無顯著變化；與LCA exo組比較，LCA exo+PTEN組A549細胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT顯著降低(P<0.001)，提示LCA exo可通過轉移miR-21調控A549細胞PTEN表達而激活PI3K/AKT信號通路。見圖8。

A為Western blot檢測4組細胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT表達水平；B為4組細胞p-PI3K/PI3K的比較；C為4組細胞p-AKT/AKT的比較；與PBS組比較，***P<0.001；與LCA exo組比較，###P<0.001。圖8 LCA exo抑制PTEN激活PI3K/AKT信號通路

3 討 論

外泌體是一類由多種活細胞分泌的納米級囊泡，可在生理狀態下和病理狀態下調控機體的生長發育以及疾病的發生發展，外泌體可存在于血液、腦脊液、腹水、唾液等體液中[9-10]。外泌體內含多種遺傳物質，如miRNA、lncRNA、circRNA等。其中，外泌體miRNA在肺癌的發生發展過程中發揮多種生物學調控功能。研究表明，經化療后的肺癌患者血清外泌體中miR-208a高表達，而抑制P21/AKT/mTOR信號通路，進而促進肺癌細胞的生長和轉移及化療耐受[11]。亦有研究表明，非小細胞肺癌患者血清外泌體中miR-17-5p表達高于健康人血清外泌體，外泌體miR-17-5p具有用于非小細胞肺癌診斷的潛力，將其與傳統標志物聯合使用，以提高肺癌早期診斷的靈敏度和特異度[12]。

肺癌患者血清外泌體中的miRNA能夠作為肺癌診斷和治療的新型靶點，有研究顯示，肺癌患者血清外泌體中miR-96作為預測順鉑耐藥的標志物，從而為肺癌患者提供更精準的治療方案，miR-96的靶向抑制劑可改善肺癌細胞對順鉑的耐藥情況[13]。miR-21已經被報道可調控肝癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的進展，如腫瘤微環境中外泌體miR-21可誘導早期肝癌的轉移，miR-21可靶向PTEN而促進卵巢癌的增殖和遷移，亦可作為乳腺癌診斷的潛在靶點[14-16]。在肺癌中，miR-21可調控脂肪酸的代謝而促進非小細胞肺癌的增殖[17]，也可調控 PTEN/AKT/GSK3β信號通路而促進肺癌的生長和上皮間質轉化[18]。本研究首先提取并鑒定了來自健康志愿者和肺癌患者血清中的外泌體，然后檢測發現肺癌患者血清外泌體中miR-21表達增加，在肺癌細胞A549中轉染miR-21 mimic后，細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著增加，說明miR-21具有促進肺癌生長和轉移的能力。miRNA是一類可調控腫瘤發生發展的RNA，其調控機制在靶向結合與靶基因mRNA的3′UTR區域，而抑制靶基因的翻譯[19]。本研究通過雙熒光素酶報告基因試驗驗證了PTEN為miR-21的靶基因，并且發現miR-21可抑制PTEN表達來促進肺癌細胞的生長和轉移能力。研究發現，肺癌患者血清外泌體可轉移miR-21至A549細胞中而促進A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力，但是將與外泌體共孵育的A549細胞轉染PTEN質粒后，細胞的增殖遷移和侵襲能力均下降，說明肺癌患者血清外泌體可通過轉移miR-21調控PTEN的表達而影響細胞的生長和轉移能力。

PI3K/AKT信號通路是調控肺癌的重要信號通路，研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路可作為非小細胞肺癌的治療靶點[20]，PI3K/AKT信號通路抑制劑可顯著抑制肺癌的發生發展[21]，亦可誘導腫瘤血管新生而促進腫瘤的生長[22]。PTEN作為PI3K/AKT信號的調控因子，可抑制PI3K和AKT的磷酸化水平而抑制PI3K/AKT信號通路，進而抑制腫瘤的生長[23]。本研究發現肺癌患者血清外泌體和miR-21可顯著提高p-PI3K和p-AKT水平，即激活PI3K/AKT信號通路，而過表達PTEN可抑制外泌體對該通路的激活。

綜上所述，血清外泌體能夠通過傳遞miR-21而調控PTEN/PI3K/AKT信號通路，進而促進肺癌的生長和轉移，但是其在臨床診斷和治療的應用還需進一步探究。