靜態核酸制備技術試劑盒在乙型肝炎低病毒載量樣本檢測中的應用*

曲人亮，楊勇衛，張 帥，劉靜靜，劉君瑋

山東省煙臺市奇山醫院檢驗科，山東煙臺 264001

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國最嚴峻的公共衛生問題之一[1]。而血清中HBV-DNA載量是檢測HBV感染最直接的指標[2]，血清中的HBV-DNA水平變化可以為乙型肝炎(以下簡稱乙肝)的臨床診治提供依據[3]。近年來，由于抗病毒藥物的應用，患者體內的HBV-DNA水平往往維持在較低水平，臨床多出現用藥后反彈的情況[4]。相關指南指出：為了避免乙肝復發，HBV-DNA需控制在實時熒光定量PCR檢測不到的水平(5～10 IU/mL)[5]。目前，國內三甲醫院多采用羅氏COBAS核酸檢測系統，其定量限在20 IU/mL，少數醫院采用國產試劑盒，其定量限普遍在100 IU/mL，靈敏度較低，不能滿足美國肝病研究協會的標準和乙肝臨床診斷治療的需求?；谝陨蠁栴}，急需一種檢測乙肝低病毒載量的技術。然而病毒載量的檢測結果往往受到實時熒光定量PCR反應過程中產生的非特異性產物的干擾，影響了結果的判斷[6]。這就對HBV-DNA的臨床檢測技術提出了更高的要求。

國家藥品監督管理局批準北京納捷診斷技術有限公司研發的HBV-DNA定量檢測試劑盒上市，靈敏度達到5 IU/mL[7]。該試劑盒采用了最新的靜態核酸制備技術試劑盒，在1個試管中完成核酸提取及擴增全過程，樣本直接加到核酸裂解液中無須混勻，具有靜態漂洗、磁珠參與PCR反應，無核酸丟失及操作步驟少、低值重復性好、實驗室污染可控的優勢，可對低病毒載量進行檢測，結果可靠性高。本研究采用世界衛生組織(WHO)標準品及臨床樣本，同時與羅氏COBAS核酸檢測系統進行比對，旨在分析靜態核酸制備技術試劑盒的檢測能力，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 WHO標準品(批號：201601)，濃度為1.0×108IU/mL，經HBV-DNA陰性血清3次100倍稀釋后，制成1.0×102IU/mL標準品。取40 mL的1.0×102IU/mL標準品稀釋樣本與10 mL HBV-DNA陰性血清混勻，制成80 IU/mL的稀釋樣本，然后采用陰性稀釋液進行1∶1倍數稀釋，依次制成濃度為80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 IU/mL的待測樣本。收集煙臺市奇山醫院80例羅氏COBAS核酸檢測系統檢測臨床樣本，其中20例表面抗原陰性體檢人員血清樣本(獻血員樣本)，20例結果小于20 IU/mL的樣本，40例結果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本。

1.2儀器與試劑 選擇北京納捷診斷試劑有限公司生產的HBV-DNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)和上海宏石醫療科技有限公司生產的SLAN-96P擴增儀進行研究。選擇羅氏COBAS核酸檢測系統進行對比檢測。

1.3方法 靜態核酸制備技術試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測系統同步對80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 IU/mL的稀釋樣本和HBV-DNA陰性血清進行檢測。

除此以外，用靜態核酸制備技術試劑盒檢測臨床樣本1～80，其中臨床樣本1～20為表面抗原陰性樣本，臨床樣本21～40為羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果小于20 IU/mL的樣本，臨床樣本41～80為羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本。

靜態核酸制備技術試劑盒：按照HBV裂解液每人份100 μL+HBV內標1.0 μL配制裂解液，充分混勻后立即按每孔100 μL分裝到PCR擴增管中。在已經分裝提取液的PCR管內加入100 μL待測樣本(校準品、質控品同樣本操作)，無須混勻；室溫靜置5～10 min。將PCR管轉移至磁力架上，靜置2～3 min，用移液器或負壓裝置吸取上清液后丟棄。保持PCR管在磁力架上，每孔加入HBV漂洗液(DWB)250 μL，靜置2 min，用移液器或負壓裝置吸取上清液后丟棄。取相應量的HBV PCR反應液及HBV酶混合液，按(HBV PCR反應液每人份43.0 μL+HBV酶混合液每人份2.0 μL)比例配制，充分混勻成PCR-Mix，即刻使用。每孔加入45.0 μL的PCR-Mix，蓋上管蓋，顛倒輕輕彈下磁珠，使PCR-Mix與磁珠充分混勻，水平瞬時離心。將PCR反應管轉移至檢測區，置于熒光定量PCR儀上進行檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0對兩種方法的抗污染性能、檢測限和定量限、精密度[即變異系數(CV)]，測定值lg差值及相關系數進行統計分析。并對兩種方法的操作性進行比較。

2 結 果

2.1靜態核酸制備技術試劑盒的抗污染性能 利用靜態核酸制備技術試劑盒對20例表面抗原陰性樣本進行4次重復檢測，結果全為陰性，符合率均為100%。靜態核酸制備技術試劑盒抗污染性能良好，試驗結果準確、有效。

2.2靜態核酸制備技術試劑盒的檢測限、定量限和精密度評價 用靜態核酸制備技術試劑盒對1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 IU/mL樣本進行了4次重復檢測。11個1.25 IU/mL樣本共檢出10個，檢出率達90.9%，2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 IU/mL樣本檢出率100.0%，表明靜態核酸制備技術試劑盒檢測限在1.25 IU/mL，定量限在2.5 IU/mL，低于試劑盒標明的5.00 IU/mL，不同濃度樣本檢測結果層次分明，分辨率高。而羅氏COBAS核酸檢測系統檢測限在20.00 IU/mL，靜態核酸制備技術試劑盒靈敏度較高，檢測限、定量限較低，見表1。

表1 靜態核酸制備技術試劑盒檢測標準品稀釋樣本的檢出率及CV

40.00、80.00 IU/mL樣本檢測結果顯示，靜態核酸制備技術試劑盒的CV分別為4.28%和4.77%，均小于5%，優于羅氏COBAS核酸檢測系統的6.51%和6.21%。靜態核酸制備技術試劑盒精密度高，檢測結果重復性較好。見表2。

表2 羅氏COBAS核酸檢測系統檢測標準品稀釋樣本的檢出率及CV

2.3對20例羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果小于20.00 IU/mL樣本的檢測結果 用靜態核酸制備技術試劑盒檢測20例羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果小于20.00 IU/mL的樣本，45%的樣本檢測結果大于5.00 IU/mL，表明靜態核酸制備技術試劑盒靈敏度明顯高于羅氏COBAS核酸檢測系統。

2.4兩種方法的準確性研究 用靜態核酸制備技術試劑盒檢測40例羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果在20.0～2.0×107IU/mL的樣本，結果顯示，兩種方法測定值lg差值均未超過±0.5。兩試劑盒相關系數為0.994 9。見表3。

表3 靜態核酸制備技術試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果比對

續表3 靜態核酸制備技術試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果比對

2.5兩種方法可操作性比較 兩種方法進行核酸制備的方法比較見表4。兩種方法PCR擴增性能比較見表5。

表5 PCR擴增性能比較

3 討 論

乙肝是我國最常見的傳染病之一，目前由于抗病毒治療藥物的應用，患者體內的病毒水平往往維持在較低水平[7]，若檢測結果不準確極易誤導臨床診斷治療，導致病情復發[8]，如何準確檢測低HBV-DNA載量樣本是實驗室急需解決的問題之一?；诿绹尾⊙芯繀f會提出的5～10 IU/mL的檢測要求，靜態核酸制備技術試劑盒較好地補充了我國HBV-DNA檢測技術的短板[5]。該技術可實現核酸提取全過程在1個試管中進行，靜態漂洗無須混勻操作，不僅避免污染且減少了核酸丟失；裂解液中含有50%構象磁珠等成分，能快速分離蛋白抓取核酸；試劑性能穩定，低值重復性好。若能實現自動化提取，將會極大提高我國基層實驗室的檢測能力。

本研究顯示，靜態核酸制備技術試劑盒抗污染能力強，定量限在2.50 IU/mL，遠高于羅氏COBAS核酸檢測系統的20.00 IU/mL，且低值重復性好，檢測結果層次分明，分辨率高。采用靜態核酸制備技術試劑盒檢測羅氏COBAS核酸檢測系統檢測結果小于20.00 IU/mL的樣本，其中45%的樣本檢測結果大于5.00 IU/mL，相比羅氏COBAS核酸檢測系統，靜態核酸制備技術試劑盒靈敏度更高，能有效防止漏檢，更適合我國臨床檢測實驗室。準確性研究結果顯示，兩種技術方法檢測結果相差較小，相關系數為0.994 9，無明顯差異。兩種方法可操作性比較，靜態核酸制備技術試劑盒在操作時間、成本、檢測通量等方面均優于羅氏COBAS核酸檢測系統。

靜態核酸制備技術試劑盒為具有獨立知識產權的國內專利技術，綜合性能顯著優于羅氏COBAS核酸檢測系統，且操作簡單、快速，但靜態核酸制備技術試劑盒處于發展初期，目前核酸提取及擴增均為人工操作，與全自動儀器相比，對操作人員的要求更高，若能制造穩定的全自動靜態核酸制備技術試劑盒設備，該技術能成為進口技術的替代產品，為臨床抗病毒治療療效觀察提供更科學、準確的依據。

靜態核酸制備技術試劑盒與羅氏COBAS核酸檢測系統檢測HBV-DNA比較，其定量限達到5.00 IU/mL，是羅氏COBAS核酸檢測系統(20.00 IU/mL)的1/4；線性范圍為5.0～2.0×109IU/mL，高于羅氏COBAS核酸檢測系統(20.0～1.2×108IU/mL)。羅氏COBAS核酸檢測系統檢測HBV-DNA在核酸提取純化后需用洗脫液從磁珠上洗脫并溶解核酸，檢測靈敏度易受洗脫和溶解效率的影響，而靜態核酸制備技術試劑盒直接在磁珠核酸中直接添加PCR擴增試劑，無須磁珠核酸洗脫溶解，檢測靈敏度不受影響；且靜態核酸制備技術試劑盒操作簡單，僅需5步即可完成核酸提取和擴增，檢測40個樣本，從核酸提取到PCR結果報告僅需2 h左右，每天檢測通量可達到3 000個樣本，而羅氏COBAS核酸檢測系統則需要7 h左右，每天檢測通量不到1 000個樣本，靜態核酸制備技術試劑盒每天檢測通量為羅氏COBAS核酸檢測系統的3倍[7]。而且靜態核酸制備技術試劑盒不需要貴重設備，國產熒光PCR儀即可檢測，儀器設備費用低，各基層醫療科研單位均可實現檢測，試劑盒成本較低，為羅氏COBAS核酸檢測系統的1/5左右，適合我國國情。