聚集素基因多態性與散發性阿爾茨海默病的關聯性研究

包瑞婷，吐瑪熱斯·塔外庫力，哈斯也提·依不來音

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種與衰老相關的神經退行性疾病［1］，也是癡呆最常見的一種形式，占全球4 680萬癡呆患者的60%以上［2］，其發病機制復雜，已成為老年人死亡的主要原因之一［3］。目前國際上還沒有有效預防或減緩AD進展的方法［4］。在臨床上，根據遺傳特點，AD可分為散發性和家族性，其中后者僅占5%［5］。AD的發病機制目前還沒有明確定論，但研究表明，遺傳因素在AD發病中可能發揮了重要作用［6］。隨著AD分子遺傳學研究的進展，大量研究表明，聚集素（clusterin，CLU）基因突變及其分子結構可通過增加β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在大腦中的沉積等方式增加AD發生率［7］。全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）發現，目前CLU基因已經成為除載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）和橋接整合因子1（bridging integrator 1，BIN1）外可能導致AD的第三大風險因子［8］。由于AD的患病率、等位基因頻率和連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）模式在不同人群之間存在差異，故本研究通過對比新疆地區漢族、維吾爾族散發性AD患者與非AD受試者CLU基因多態性，探索CLU基因多態性與散發性AD的關聯性，以期為AD發病機制的探討提供借鑒。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年8月至2019年6月在新疆醫科大學第二附屬醫院、新疆醫科大學第七附屬醫院、烏魯木齊市六道灣醫院就診的散發性AD患者131例為病例組。納入標準：（1）符合美國《精神疾病診斷與統計手冊》［9］中癡呆的診斷標準和“很可能AD”的診斷標準；（2）在新疆地區居住時間＞10年；（3）年齡≥65歲；（4）民族：漢族或維吾爾族。排除標準：（1）由抑郁癥等引起的假性癡呆患者；（2）目前正處于心、血管、肺、肝、腎等臟器或組織疾病急性期的患者；（3）快速進展性癡呆患者；（4）血管性癡呆患者；（5）其他神經系統疾病和食物或藥物中毒引起的癡呆患者；（6）患有任何腫瘤的患者；（7）因聽力障礙、視力障礙等易引起認知功能下降的患者。選取同期在新疆醫科大學第二附屬醫院進行體檢的非AD患者或健康志愿者128例為對照組。納入標準：（1）年齡≥65歲；（2）民族：漢族或維吾爾族；（3）在新疆地區居住時間＞10年；（4）與AD患者生活環境、飲食習慣相似；（5）無AD家族史。排除標準：不能確診的疑似AD患者。兩組性別、年齡、民族、文化程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 病例組與對照組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between case group and control group

1.2 CLU基因多態性測定方法 于病例組入院后第4天、對照組體檢當天清晨采集其空腹外周靜脈血3 ml，采用TIANamp Genomic DNA kit提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產〕提取DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用PCR及DNA測序檢測CLU基因單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphisms，SNP），其中SNP位點信息全部來自NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/），搜索并記錄目標基因座的準確序列。CLU基因SNP（rs11136000、rs1532278）位點的基因分型由博淼生物科技（北京）有限公司采用連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）-PCR法完成。CLU基因SNP位點引物序列見表2。

表2 CLU基因SNP位點引物序列Table 2 Primer sequence of CLU gene SNP site

1.3 統計學方法 采用PLINK 1.07軟件進行統計學分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；漢族受試者發生散發性AD的影響因素分析采用加性模型分析；采用Haploview軟件計算CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型（TT和CC）頻率。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組漢族、維吾爾族受試者SNP位點基因型及等位基因頻率比較 病例組與對照組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點TC基因型占比低于對照組，CC基因型占比高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；病例組與對照組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3～4。病例組與對照組維吾爾族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型及等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5～6。

表3 病例組與對照組漢族受試者rs11136000位點基因型及等位基因頻率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of genotype and allele frequency of rs11136000 site in Han participants between case group and control group

表4 病例組與對照組漢族受試者rs1532278位點基因型及等位基因頻率比較〔n（%）〕Table 4 Comparison of genotype and allele frequency of rs1532278 site in Han participants between case group and control group

表5 病例組與對照組維吾爾族受試者rs11136000位點基因型及等位基因頻率比較〔n（%）〕Table 5 Comparison of genotype and allele frequency of rs11136000 site in Uygur participants between case group and control group

表6 病例組與對照組維吾爾族受試者rs1532278位點基因型及等位基因頻率比較〔n（%）〕Table 6 Comparison of genotype and allele frequency of rs1532278 site in Uygur participants between case group and control group

2.2 漢族受試者發生散發性AD影響因素的單因素Logistic回歸分析 分別以漢族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型（賦值：TT=1，TC=2，CC=3）、等位基因為自變量（賦值：T=1，C=0），散發性AD發生情況為因變量（賦值：發生=1，未發生=0），進行加性模型分析，結果顯示，rs11136000、rs1532278位點等位基因T是漢族受試者發生散發性AD的保護因素（P＜0.05），見表7。

表7 漢族受試者發生散發性AD影響因素的加性模型分析Table 7 Additive model analysis of influencing factors of sporadic AD in Han participants

2.3 病例組漢族與維吾爾族受試者SNP位點基因型及等位基因頻率比較 病例組漢族與維吾爾族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型比較，差異有統計學意義（χ2值分別為15.514、14.649，P值分別為＜0.001、0.001）；病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點TT、TC基因型占比低于維吾爾族，CC基因型占比高于維吾爾族，差異有統計學意義（P＜0.05）。病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點等位基因T頻率低于維吾爾族，差異有統計學意義（χ2值分別為16.843、17.053，P值均＜0.001）。

2.4 CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率 病例組與對照組漢族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率比較，差異無統計學意義（χ2=2.885，P=0.091）。病例組與對照組維吾爾族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率比較，差異無統計學意義（χ2=0.603，P=0.438）。病例組漢族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型TT基因型頻率高于維吾爾族，差異有統計學意義（χ2=17.741，P＜0.001），見表8、圖1。

圖1 CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型分布的連鎖不平衡圖Figure 1 Linkage disequilibrium diagram for haplotypes of CLU gene rs11136000-rs1532278

表8 對照組、病例組漢族、維吾爾族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率〔n（%）〕Table 8 Genotype frequency of rs11136000-rs1532278 haplotype in CLU gene of Han and Uygur subjects in control group and case group

3 討論

AD依據其發病人群特點可分為家族性AD和散發性AD，而CLU基因是散發性AD的風險基因［10］，位于人類第八號染色體上（8p21-12）［11］。自2009年LAMBERT等［12］發現CLU基因的3個位點（rs11136000、rs2279590和rs9331888）與高加索人群AD易感性有關以來，CLU基因多態性與AD的相關性一直是全世界的研究熱點。AD主要病理特征是大腦中含Aβ多肽的老年斑的表達、形成和沉積增加。CLU基因多態性已被證實可促進Aβ在大腦中的沉積，尤其是在額葉、扣帶回的沉積，其中攜帶rs11136000位點CC基因型的受試者比攜帶TC基因型的受試者Aβ沉積多，而攜帶TT基因型的受試者Aβ沉積最少［8］。由此說明，CLU基因多態性可通過增加Aβ在大腦功能區的沉積而引發AD。芬蘭的一項病例對照研究發現，CLU基因rs11136000位點等位基因C可使腦脊液中Aβ1-42明顯降低［13］。而目前已知的AD相關風險基因位點中，只有ApoEε4等位基因可使腦脊液中Aβ1-42明顯降低，提示CLU基因rs11136000位點等位基因C與ApoE ε4在AD的發生中具有類似的生物學功能。當腦脊液中的Aβ1-42降低時，意味著Aβ1-42滯留于大腦淀粉樣斑塊中，同樣說明CLU基因變異是通過調節AD的生物標志物Aβ在大腦中的沉積而誘導發病的。此外，相關影像學研究也證明了CLU基因多態性與腦白質微結構改變［14］以及海馬體萎縮［15］有關，這種腦白質微結構的變化反映了腦白質發育的脆弱性，而這種脆弱性降低了腦白質對AD相關神經病理的恢復能力，并可能會導致腦白質血供減少。更有研究表明，CLU基因多態性可促進輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）向AD發展，該研究的受試者基線時認知功能正常，但在隨后發生MCI或AD的個體中，攜帶rs11136000位點等位基因C者的認知功能衰退速度明顯快于未攜帶rs11136000位點等位基因C者，該研究證明CLU基因rs11136000位點等位基因C是MCI向AD進展的獨立危險因素，從遺傳學角度使CLU基因座在MCI向AD進展中具有獨立貢獻這一假設成立［16］。因此，很多科學家致力于研究CLU基因多態性與AD的相關性，但研究結果因目標人群及地區而異。目前，尚未見以我國居民為研究對象分析CLU基因多態性與AD之間相關性的研究，針對新疆地區的相關研究目前僅有1項，該研究指出CLU基因rs11136000位點多態性與新疆哈薩克族人群發生AD可能有關［17］。但有學者認為，樣本量小、研究設計不完備或研究對象間異質性均會導致研究結果不同［3］。一項針對我國華南地區漢族人群的研究顯示，rs1136000位點多態性與AD無相關性［18］。因此對于CLU基因多態性與新疆地區漢族人群和維吾爾族人群AD易感性之間的關系仍需進一步研究，本研究旨在分析CLU基因多態性與散發性AD的關聯性。

本研究結果顯示，病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點TC基因型占比低于對照組，CC基因型占比高于對照組，提示在新疆漢族人群中CLU基因rs11136000、rs1532278位點基因型分布差異可能與散發性AD易感性有關。加性模型分析結果顯示，rs11136000、rs1532278位點等位基因T是漢族受試者發生散發性AD的保護因素，提示新疆漢族人群攜帶等位基因T可降低散發性AD發生風險。MORENO等［19］在哥倫比亞進行的一項病例對照研究顯示，攜帶CLU基因rs11136000位點等位基因T與AD發生風險降低有關。然而，本研究結果顯示，病例組與對照組維吾爾族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型及等位基因頻率比較差異無統計學意義，這與大多數民族的研究結果一致，如BOCHAROVA等［20］研究顯示，在俄羅斯人群中，AD組和健康對照組CLU基因rs1532278位點等位基因頻率、基因型和單倍體無明顯區別；SHANKARAPPA等［21］在印度南部開展的一項CLU基因多態性與AD患者及認知功能正常人群之間的關系研究證實，CLU基因rs11136000位點多態性與AD無關聯〔OR=1.64，95%CI（0.78，3.42），P=0.18〕；2020年SANTOS等［22］在巴西東南部實施的一項病例對照研究證實，CLU基因rs11136000位點等位基因T與AD發病風險無關〔OR=0.840，95%CI（0.537，1.314），P=0.445〕。這些研究結果說明不同地區、民族人群CLU基因多態性與AD易感性之間的關系很復雜?？紤]到新疆地域寬廣、民族眾多，本研究進一步分析病例組漢族與維吾爾族受試者rs11136000、rs1532278位點基因型及等位基因頻率，結果顯示，病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點TT、TC基因型占比低于維吾爾族，CC基因型占比高于維吾爾族；病例組漢族受試者rs11136000、rs1532278位點等位基因T頻率低于維吾爾族；證明在新疆漢族和維吾爾族人群中，導致散發性AD易感性的基因突變位點并不都是同一位點，兩民族間致病基因位點存在差異，分析原因，本研究組考慮如下：（1）可能與兩民族生活習慣及飲食習慣的差異有關；（2）可能與散發性AD的發病機制復雜有關，且容易受環境因素、遺傳因素等的影響，單一的民族因素無法解釋CLU基因多態性與散發性AD之間的相關性；（3）可能與本研究樣本量小、代表性不全面有關，尚需要大樣本量、多因素的實驗分析解釋其原因。此外，本研究結果顯示，病例組與對照組漢族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率比較差異無統計學意義，病例組與對照組維吾爾族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型基因型頻率比較差異無統計學意義，提示漢族散發性AD患者與非AD人群、維吾爾族散發性AD患者與非AD人群單體型基因型分布均無差異。病例組漢族受試者CLU基因上rs11136000-rs1532278單體型TT基因型頻率高于維吾爾族，提示CLU基因rs11136000、rs1532278位點基因型、等位基因分布在漢族與維吾爾族散發性AD患者中具有明顯差異。

綜上所述，CLU基因rs11136000、rs1532278位點多態性與新疆漢族人群發生散發性AD有關，其中攜帶等位基因T可降低其散發性AD發生風險；此外，rs11136000、rs1532278位點多態性在新疆漢族與維吾爾族散發性AD患者中存在明顯差異。但本研究樣本量較小，樣本來源未覆蓋整個新疆地區，因此研究結果并不能很好地代表整個新疆地區，仍有待更大樣本量的研究來進一步驗證本研究結論。

志謝：感謝新疆醫科大學第七附屬醫院、烏魯木齊市六道灣醫院在本研究病例收集過程中的大力支持。

作者貢獻：包瑞婷、哈斯也提·依不來音進行文章的構思與設計；包瑞婷、吐瑪熱斯·塔外庫力進行研究的可行性分析及實施；包瑞婷進行數據收集、整理、分析及結果解釋，并撰寫論文；哈斯也提·依不來音進行文章的質量控制和審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。