慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的動物模型制備方法與特點

陳曦，王明宇，孫曉琳，安克江·安尼瓦爾，朱治萩，楊蘇喬

肺動脈高壓共分為五大類，其中慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）屬于第四大類，其確切的發病機制尚未闡明。目前公認的CTEPH的主要發病原因是急性肺栓塞未得到及時診治或反復發生血栓栓塞后，血栓無法完全溶解，逐漸機化，阻塞肺血管床，導致肺血管重塑，在血栓機械性阻塞的基礎上加重血流動力學異常，產生肺動脈高壓［1］。近年來，隨著人們對急性肺栓塞的重視程度不斷提高，CTEPH的檢出率也隨之提高。國外急性肺栓塞患者CTEPH的發病率為0.45%～6.20%［2］，我國急性肺栓塞患者2年后CTEPH累積發病率約為1.3%［3］。然而，急性肺栓塞并不是CTEPH發生發展的唯一原因，CTEPH還與凝血和纖溶機制異常、炎癥、遺傳易感因素、血管新生及原位血栓形成等多種因素密切相關［4］，但其具體分子機制尚不明確。由于CTEPH患者疾病負擔較重，未經治療的患者預后極差，因此需要對其發生發展的病理生理機制進行深入探索。動物模型的建立可以有效推動CTEPH發病機制的研究，為疾病早期預警和個體化防治提供研究基礎。本文旨在綜述CTEPH動物模型研究進展，為探討CTEPH的發病機制、早期預警及個體化治療提供依據。

1 CTEPH的動物模型種類概述

理想的CTEPH動物模型一般具有以下特點：（1）血栓持續存在并機化，產生慢性肺動脈阻塞；（2）非阻塞部位肺血管病變、右心室重構、肺動脈高壓持續存在［5］；（3）動物血管清晰、實驗操作方便；（4）經濟且可重復。目前較為成熟的CTEPH模型選用的動物類型包括羊、豬、犬、兔、嚙齒類動物（大鼠、小鼠）。不同的動物由于其基因構成、生理結構和生活習性等方面不同而各具特點，適用于不同類型的實驗。

大體型動物如羊、豬、犬等操作方便，麻醉、呼吸易控制，術中機械通氣在呼吸頻率、潮氣量、氧濃度的選擇上較中小體型動物容易掌控。同時大體型動物的解剖結構與人類相似，適合進行血流動力學、影像學、解剖學以及手術治療的實驗研究。如使用陶瓷念珠輸入法建立豬、犬的CTEPH模型，經動物頸靜脈置管，反復多次注入陶瓷念珠，可造成其外周肺動脈的物理性栓塞，可用于CTEPH影像學診斷技術和病理生理特點的研究［6］。然而，此類方法所需要的實驗動物和手術材料的獲得成本較高，術后護理難度較大，不宜廣泛開展。

中體型動物的研究顯示，可以通過向犬、兔等動物的頸靜脈注入自體血栓來誘導CTEPH的發生［7-8］。但犬類性情兇猛，價格較高；兔類喜活動，與CTEPH患者運動不耐受的實際情況相違背，均不能得到有效推廣和應用。

以鼠類為主要代表的嚙齒類動物被視為“標準實驗動物”，其先天遺傳性狀、后天繁育條件、微生物攜帶狀況、營養需求及環境因素等方面均可受到全面控制，能保證實驗結果的可靠性、精確性、均一性、可重復性和可比性［9］。盡管其體型較小、血管壁薄、對實驗技術操作的要求較高，但由于其遺傳背景明確、模型性狀顯著且穩定、質量和規格可在一定程度上自由選擇、相應的檢測試劑全面、價格合理，是目前最理想的動物模型種類。并且，由于鼠類品種和基因的多樣性，其能夠模擬不同病種和患病程度［10］，在CTEPH動物模型的構建中發揮了至關重要的作用。

2 CTEPH嚙齒類動物模型的制備方法與特點

制備CTEPH嚙齒類動物模型的方法有很多，主要制作原理為模擬靜脈血栓形成后，反復多次栓塞于肺動脈導致CTEPH發生，主要方法包括栓子注入法和血管結扎法。

2.1 自體血栓注入法 LI等［11］使用自體血栓注入法成功制備CTEPH大鼠模型，其2周內向大鼠頸靜脈注射自體血栓2次，并使用氨甲環酸抑制纖溶。然而這種造模方法穩定性較差，且動物模型表現出的病情嚴重程度與人體差異較大［12］。隨著炎癥機制如葡萄球菌感染、起搏器感染、腦室-心房分流術、慢性骨髓炎、炎癥性腸病等逐漸被證實與CTEPH的發生發展密切相關［13］，研究者們開始嘗試模擬炎癥環境以增加動物模型的肺動脈壓。WU等［14］以8周齡雄性SD大鼠為材料，分別在第1、4、11天將其用水合氯醛麻醉后，向其左頸靜脈注射自體血栓，并使用氨甲環酸抑制纖溶；同時，向一部分大鼠體內注射卡拉膠以維持無菌炎癥細胞環境，在炎癥機制的參與下使肺動脈壓進一步升高；此外，向所有大鼠體內注入青霉素以預防感染；結果表明，單純注入自體血栓的CTEPH模型大鼠的平均肺動脈壓〔（25.51±1.13）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）〕明顯高于對照組大鼠〔（15.92±1.13）mm Hg〕，而注射自體血栓聯合卡拉膠的大鼠平均肺動脈壓更高〔（29.82±1.26）mm Hg〕；解剖后發現，注射自體血栓聯合卡拉膠的大鼠病理特點更加典型，血管壁增厚、血管重塑與內膜增生更明顯，且出現了洋蔥皮樣增生，也更符合人體實際情況。這一動物模型制作簡便、利于維護、特征典型，還可以通過計算血管內沉積的血栓數量來量化肺栓塞的嚴重程度，適合用于研究各類細胞因子、炎性遞質等在CTEPH病理生理過程中發揮的作用。

自體血栓注入法在小鼠中同樣得到了成功應用。繆冉等［15］在戊巴比妥鈉麻醉的小鼠頸外靜脈注入自體白色血栓使其發生栓塞，首次注入血栓后分別于1、2、3周進行自體血栓重復輸注，注入血栓35～40個/次，全程使用氨甲環酸防止血栓自溶，并應用慶大霉素防止感染；6周后小鼠右心室收縮壓明顯升高，右心室肥大指數明顯增加；形態學上也發生了CTEPH的典型改變，即血管中膜平滑肌層增厚，平滑肌細胞增殖，管腔明顯縮小，部分管腔近乎閉合；肺中可見肺間質增厚，炎性細胞明顯浸潤，部分遠端肺動脈中發現大量紅細胞聚集；栓塞較多部位可見肺泡融合或膨脹不全，肺泡壁充血、水腫；造模成功率可達50%，小鼠死亡主要是由于自體血栓過大或過多，堵塞主肺動脈，導致右心室負荷過重。如果將這種造模方法推廣至基礎研究中，在注入的血栓大小和數量及維持血栓和血流動力學穩定等方面仍有一定的優化空間。

2.2 體外栓子注入法 由于嚙齒類動物體型較小，構建大體型動物模型時應用的葡聚糖凝膠G50和陶瓷念珠等體外栓子并不適用。ARIAS-LOZA等［16］使用了有纖維蛋白膠原涂層的聚苯乙烯微球以確保栓子表面與血管內壁更好地黏附，此法成功模擬了肺栓塞亞急性期背景下的肺動脈高壓，若要模擬CTEPH動物模型則需要更長的觀察時間。NETO-NEVES等［17］向大鼠頸靜脈注射聚苯乙烯微球，同時注射SU5416以抑制血管內皮生長因子受體，連續觀察6周發現大鼠肺動脈壓持續升高，并伴有右心室肥大、功能障礙以及運動耐量下降，符合CTEPH的臨床表現。這一實驗也佐證了栓塞后血管生成減少對CTEPH發病存在影響，但使用聚苯乙烯等材料制成的微球無法溶解，不能完全模擬CTEPH的發病機制，而新型有機材料的發現使這一問題有了改進。KARPOV等［18］4 d內向大鼠靜脈內共注射8次可溶性海藻酸鈉微球，持續觀察18周，發現大鼠肺動脈壓穩定增加、運動耐量下降、內皮功能發生障礙，并發生了形態學上的變化；該方法造模成功率為56%，動物死亡主要是由于無法耐受栓子而發生了缺血性腦卒中或急性心力衰竭。該模型避免使用了氨甲環酸，降低了纖溶抑制劑對實驗的影響，同時模擬了無菌炎癥環境下CTEPH的病理生理變化，此法可以嘗試應用于CTEPH病理生理機制，尤其是針對血流動力學效應方面的研究。

2.3 左肺動脈結扎法 YUN等［19］通過結扎大鼠左肺動脈以引起肺血管重構和持續收縮，從而模擬嚴重CTEPH患者的動物模型，結果顯示，在術后第2周和第5周時實驗組右心室收縮壓與D-二聚體水平明顯高于對照組，且實驗組大鼠出現了右心室肥厚與遠端肺血管重塑。此法盡管成功再現了CTEPH患者血管張力的變化，但是沒有模擬臨床病理過程中出現的內皮功能障礙與無菌性炎癥環境等［20］，若要在臨床研究中使用還需在造模過程中結合其他方法以提高模型擬合程度。

2.4 下腔靜脈結扎法 近年來，下腔靜脈結扎法被視為最能反映深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）病理生理過程的小鼠造模方法［21］，但這種方法制備的DVT模型僅能發生輕微的肺動脈內皮功能障礙。BRANDT等［22］結扎了雄性C57BL/6小鼠的下腔靜脈與左腎靜脈，保留了所有側支，成功制備了小鼠DVT模型，在此基礎上經小鼠眼眶后靜脈竇每間隔15 min注射凝血酶166 U/kg，共3次，誘導其發生非致命性伴血流動力學改變的肺栓塞，通過高頻超聲和超聲心動圖觀察小鼠的血管情況，成功觀察到右心室結構和功能障礙、左心室受壓以及肺動脈加速時間的縮短；將小鼠解剖后發現其肺動脈內可見血栓栓塞、肺動脈平滑肌細胞增殖/肥大等病理特征。這一造模方法已逐漸應用于CTEPH的基礎研究［23］，但由于不同動物的纖溶抗性不同，這一造模方法尚未在其他類型動物上構建成功。FREY等［24］在切除小鼠脾臟后結扎其腎靜脈下方的下腔靜脈，28 d后，實驗組小鼠血栓消融明顯延遲。雖然沒有直接模擬肺栓塞的病理過程，但其提供了一種新的造模思路來研究特定臨床條件下的CTEPH發病過程。

3 小結及展望

綜上所述，目前在建立CTEPH動物模型時，每種實驗方法均存在一定的局限性。CTEPH模型應具有肺動脈壓持續升高、血栓形成和栓塞引起血管床穩定下降的雙重特點。根據現有證據，目前還沒有一種最優的方法來模擬CTEPH模型，且具體模型和動物種類的選擇應根據研究目標確定。在今后的研究中，可以嘗試在下腔靜脈結扎法的基礎上，結合血栓注入法中誘導與維持血栓的技巧，如使用氨甲環酸抑制纖溶、改變小鼠體位以促進其血栓形成［11］、注射卡拉膠以維持慢性炎癥狀態等方法，以期建立更符合人體臨床及病理特點的CTEPH動物模型，為探索CTEPH的發病機制及個體化防治策略提供基礎。

作者貢獻：陳曦進行文章的構思與設計撰寫，及修訂論文；陳曦、王明宇、孫曉琳、安克江·安尼瓦爾、朱治萩進行文獻/資料收集、整理；楊蘇喬進行文章的可行性分析，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。