TANK結合激酶1在肺動脈高壓中的作用機制

劉美洋，孫佳偉，崔志峰，宮小薇，袁雅冬

研究表明，肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）可能影響全球約1%的人口，在65歲以上人群中，PH的患病率已達10%［1］。PH是一種由肺動脈內皮細胞功能障礙、肺動脈平滑肌細胞過度增殖、細胞凋亡異常等引起的復雜疾病，其特征是肺血管阻力增加、血管重塑、血管阻塞，最終導致右心衰竭和死亡［2］。在PH的病理生理過程中，巨噬細胞中損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）相關先天免疫［3］、巨噬細胞代謝以及肺血管系統細胞外基質（extracellular matrix，ECM）重塑［4］均發揮重要作用。隨著研究的逐步深入，TANK結合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）逐漸被大家關注，其是先天免疫的關鍵酶，同時可參與細胞代謝的調節，亦可參與ECM重塑。因此，本文立足于TBK1，綜述TBK1的結構與活化機制、巨噬細胞與PH的關系及TBK1在PH患者巨噬細胞DAMP相關先天免疫、巨噬細胞代謝、肺血管系統ECM重塑中的作用，旨在進一步闡述PH的病理機制，為其治療提供新的方向與靶點。

1 TBK1的結構與活化機制

1.1 TBK1的結構 TBK1也稱為NF-κB激活蛋白（NF-κB- activating kinase，NAK）或T2K，屬于IκB激酶（IκB kinase，IKK）家族。TBK1最初被確定為介導TANK激活NF-κB能力的激酶［5］。TBK1是由729個氨基酸組成的蛋白質，包含4個主要結構域，分別為激酶結構域、泛素樣結構域（ubiquitin-like domain，ULD）、C末端結構域（C-terminal domain，CTD）和卷曲螺旋結構域（coiled-coil-domain，CCD）（包括CCD1和CCD2）［6］。其中，CCD1和CCD2構成一個α螺旋支架二聚化結構域（α-helical scaffold dimerization domain，SDD）［7］。與經典IKK（IKKα、IKKβ）相比，CCD1和CCD2共享一個ULD，這是最佳激酶活性所必需的，但TBK1結構上缺乏C-末端NF-κB必需調節劑（NF-κB essential modulator，NEMO）結合結構域［8］，因此也就失去了與結構蛋白NEMO結合的可能，NEMO雖然沒有催化活性，但卻是經典NF-κB活化途徑中的必需結構蛋白［9］。NEMO是NF-κB介導的信號傳導的關鍵調節劑，其通過傳輸細胞外或細胞內信號，控制NF-κB［10］。TBK1信號通路的活化則依賴于其他接頭蛋白的參與［11］，如TRAF家族成員相關的NF-κB激動子、NAK相關蛋白1（NAK-associated protrin 1，NAP1）和視神經蛋白［12］。這些接頭蛋白的結構及作用模式均類似于NEMO［13］，均與TBK1直接相互作用，形成蛋白酶復合物，進而激活下游蛋白因子。

1.2 TBK1的活化機制 TBK1的活化是由多種方式調節的，如磷酸化、泛素化、激酶活性和防止功能性TBK1復合物的形成［14］等。

1.2.1 磷酸化 TBK1未被激活時以二聚體形式存在，當接收到活化信號時，TBK1發生折疊并開始成簇聚集，使得分子間相互接觸而激活激酶活性區，導致第172位絲氨酸發生自磷酸化。磷酸化的TBK1會通過類似正反饋調節的方式，進一步激活更多的TBK1，以達到級聯放大的活化效果［15］。TBK1自磷酸化過程受多種激酶及磷酸酶的調控，最早發現的關鍵激酶是糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），其可與TBK1結合而輔助TBK1的自磷酸化［16］。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitory protein，RKIP）則是TBK1激酶的底物，TBK1磷酸化RKIP后，可進一步促進TBK1自磷酸化［17］。同時，第179位酪氨酸的磷酸化對TBK1的激活有促進作用，此過程由酪氨酸激酶Src進行催化［18］。然而，終止TBK1磷酸化則是由多種磷酸酶進行調控的，且去除S172上的磷酸集團后TBK1可恢復未激活狀態。其中蛋白磷酸酶4［19］、蛋白磷酸酶1B（protein phosphatase 1B，PPM1B）［20］以及細胞分裂周期25A（cell division cycle 25A，CDC25A）［21］均參與終止TBK1磷酸化的過程。此外，還可通過其他途徑間接地終止TBK1磷酸化，如Src蛋白激酶家族成員Lck、Hck及Fgr［22］、糖皮質激素［23］等。

1.2.2 泛素化 除磷酸化/去磷酸化外，泛素化/去泛素化是調節TBK1活化的另一種重要方式。E3泛素連接酶可介導TBK1上的K63連接的多泛素化并促進其活化［24］。E3泛素連接酶中的MIB1、MIB2和Nrdp1通過促進K63連接的多泛素化激活TBK1［25］。研究表明，同時存在的幾種去泛素化酶可以通過破壞K63連接的多泛素化來終止TBK1的激活，如腫瘤抑制基因CYLD可去除K63連接的多泛素鏈［26］，A20調節復合物可拮抗K63-TBK1的連鎖多泛素化，該復合物包括泛素編輯酶A20（也稱為TNFAIP3）、Tax1結合蛋白1（Tax1 binding protein 1，TAX1BP1）和A20結合的NF-κB抑制物1（A20-binding inhibitor of NF-κB 1，ABIN1）［27-28］。

1.2.3 激酶活性 TBK1為先天免疫中的關鍵激酶，可以通過調節TBK1激酶的活性來調節其介導的免疫反應。含有Src同源結構域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）可以不依賴磷酸酶活性來抑制TBK1活性，TBK1激酶的結構域可以直接與SHP-2上的C末端結構域結合，進而抑制其活性及干擾素（interferon，IFN）-β的產生［29］。MCCOY等［23］發現，糖皮質激素地塞米松不僅可抑制TBK1磷酸化，還可以通過抑制其激酶活性來影響其活性。

1.2.4 防止功能性TBK1復合物的形成 功能性TBK1復合物包括含TBK1、IKKε、TRAF3、干擾素調節因子（interferon regulatory factor，IRF）3和其他接頭分子〔TRIF、線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）或干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）〕的復合物，其形成對TBK1的活化至關重要。研究發現，MIP-T3可與TRAF3蛋白特異性相互作用，這可能會阻礙功能性TRAF3-TBK1復合物的形成，從而終止IFN-β的激活［30］。SIKE（IKKε抑制因子）可隔離IKKε/TBK1，其可作為IKKε/TBK1的生理抑制因子［31］。研究發現，AVSSTING-TBK1復合物可通過空間位阻的方式特異性破壞干擾素刺激基因56（IFN-stimulated gene 56，ISG56），進而影響免疫反應［32］。

2 巨噬細胞與PH的關系

PH發病機制復雜，受多種因素影響。炎癥是PH的標志之一，與其發病機制密切相關。PH不僅可作為各種全身炎癥狀態的并發癥，如紅斑狼瘡、硬皮病、混合性結締組織病、橋本甲狀腺炎、Castleman病、POEMS綜合征、HIV感染和自身免疫性疾病［33］。同時，研究發現，PH患者肺血管病變內可觀察到大量巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞等炎癥細胞浸潤，最終導致肺血管內皮細胞損傷及平滑肌細胞增殖，進而引發肺血管重構，這提示免疫炎癥反應參與PH的發生發展［34］。研究表明，巨噬細胞是PH病變血管周圍最主要的炎癥細胞［35］。巨噬細胞具有高度可塑性，其在炎癥不同階段針對外界信號作出不同反應，并可分化為不同表型，根據其表型和分泌的細胞因子可將其分為經典激活的M1型巨噬細胞和替代激活的M2型巨噬細胞兩種亞型，一定條件下二者可相互轉化［36］。巨噬細胞M1型/M2型極化失衡可誘發并促進如PH、動脈粥樣硬化等多種疾病的進展［37］。其中M1型巨噬細胞可分泌多種促炎因子，如IL-6、IL-12、IL-18、IL-23和TNF-α，并上調CD86、CD80、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、趨化因子（C-X-C基序）配體〔chemokine（C-X-C motif）ligand，CXCL〕9、CXCL10等的表達，防御細胞內病原體的感染，同時也會抑制組織周圍的細胞增殖，導致組織損傷；M2型巨噬細胞可分泌抗炎因子如IL-10、IL-1受體拮抗劑，并上調精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、CD206和CD163的表達，從而促進細胞增殖、傷口愈合及組織修復，在炎癥后期起重要作用［38］。

3 TBK1在PH患者巨噬細胞DAMP相關先天免疫中的作用

近年來研究發現，消除PH中的關鍵免疫過程可能逆轉血管重塑，進而緩解PH［39］。先天免疫系統是人體抵抗感染的第一道防線，該系統可以通過病原體相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）途徑來識別病原體。同時，MATZINGER［40］發現，人體正在使用的與PAMP類似的系統在沒有感染的情況下，可發出組織損傷的信號，并將其命名為DAMP。研究發現，PH患者巨噬細胞中可發生DAMP激活以促進肺血管重塑［3］。與PAMP類似，DAMP可被模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別并能夠在巨噬細胞中引發免疫反應［41］。PRR主要包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、維甲酸誘導基因Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ）樣受體、核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體和C型凝集素受體［42-43］，這4類受體可以識別脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、病毒RNA、雙鏈DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等物質并向下游通路傳導信號，進而激活免疫系統并引發炎癥反應［44］。MELOCHE等［45］發現，DNA損傷對PH的發展很重要。有研究者在PH動物模型肺和重塑的動脈中均發現了高水平的DNA損傷［46］。在PH患者中，越來越多的證據表明，氧化應激和炎癥通過促進血管過度收縮和細胞增殖來促進血管重塑［47-48］，得到公認的是這些因素也可導致DNA損傷［49］。

在先天免疫中，環-磷酸鳥苷-磷酸腺苷合酶（cyclic-GMP-AMP synthas，cGAS）發揮著重要作用［50-51］，其是一種細胞DNA感受器，主要識別dsDNA并激活先天免疫應答［52］。其中TBK1是cGAS信號通路中的關鍵蛋白，且cGAS-STINGTBK1軸被認為是先天免疫的主要信號通路，與多種疾病密切相關［50-51］。當細胞受到損傷時，dsDNA可釋放至細胞質［53］，并與cGAS結合，形成一個2∶2的二聚體結構［54-55］，從而引發活性位點的改變；激活狀態的cGAS可將ATP和三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）合成環鳥苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP），而cGAMP可以作為第二信使直接激活內質網上的STING；隨后，激活的STING從內質網轉運到高爾基體中間室和高爾基體［56］，其中高爾基體上激活的STING可招募并激活TBK1，而TBK1又可招募并磷酸化下游IRF3［57］；STING同時可以激活IKK，并磷酸化NF-κB的抑制劑IκB家族；磷酸化的IκB蛋白被泛素-蛋白酶體途徑降解［58］，此時NF-κB進入細胞核，并與干擾素調節劑IRF3協同作用，誘導M1型相關炎癥因子的表達，從而引起炎癥反應及免疫反應。研究發現，在低氧相關PH小鼠病程早期肺泡灌洗液中，M1型相關炎癥因子水平升高［59］，且IL-6水平隨PH嚴重程度的加重而升高［60］。因此，在巨噬細胞中，TBK1參與的先天免疫可促進PH的病理變化。

4 TBK1在PH患者巨噬細胞代謝中的作用

細胞代謝穩態需要通過合成代謝過程將營養物質（如葡萄糖和氨基酸）和能量（ATP）協調轉化為大分子物質（如蛋白質、核酸和脂質），并將這些大分子物質再循環回其營養成分，從而進一步分解代謝，產生能量。隨著營養物質的不斷輸入，這種營養物質和大分子物質的相互轉化理論上可以自我維持。然而，細胞和有機體擁有不同的系統來感知營養和能量的波動，從而使其代謝狀態適應營養供應或消耗［61］。巨噬細胞的極化方向與能量代謝方式密切相關，而PH患者巨噬細胞代謝變化主要包括糖酵解、脂肪酸氧化等。

4.1 糖酵解 Warburg效應最初是在癌癥中定義的，指在正常氧濃度條件下葡萄糖最終產生乳酸［62］。COTTRILL等［63］發現，在許多情況下，Warburg效應是PH的主要致病機制。1970年，HARD［62］首次發現活化的巨噬細胞中糖酵解水平上升，同時氧化磷酸化及ATP水平明顯降低，表現出類似腫瘤細胞的Warburg效應。研究發現，M1型巨噬細胞主要以有氧糖酵解及戊糖磷酸途徑來提供能量，M2型巨噬細胞主要以氧化磷酸化及脂肪酸氧化來提供能量［36］。mTORC1是一種營養感應蛋白激酶，是細胞代謝的主要調節劑，其被激活時可促進生物合成過程，其還可誘導糖酵解和谷氨酰胺分解過程以進一步支持合成代謝功能。DüVEL等［64］發現，mTORC1可以刺激糖酵解途徑，這是通過激活影響缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α和甾醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBP）1和SREBP2的代謝基因靶標的轉錄程序來實現的。BODUR等［65］在細胞實驗中發現，TBK1可以與mTOR上特異性位點（在S2159上）結合并激活mTORC1，首次證明了TBK1可直接激活mTORC1。總之，TBK1可能通過mTORC1來影響糖酵解，進而影響巨噬細胞極化，參與PH的形成。

4.2 脂肪酸氧化 脂質是巨噬細胞極化過程中的關鍵代謝物。M1型巨噬細胞合成脂肪酸并將其用作合成炎癥遞質的前體，同時從有氧糖酵解中獲得大部分ATP，而M2型巨噬細胞具有由脂肪酸氧化驅動的功能性線粒體呼吸鏈。脂肪酸代謝包括多個步驟，如細胞脂肪酸攝取和儲存、脂肪酸轉運到線粒體、線粒體脂肪酸β-氧化和脂肪酸合成等。研究顯示，PH患者的心臟和肺臟中存在脂肪酸代謝失衡［66-67］。2018年的一項研究發現，在高脂飲食小鼠的正常脂肪細胞中，TBK1的表達和活化水平增加，而特異性敲除脂肪細胞中TBK1后小鼠對高脂飲食誘導的肥胖具有抵抗性［68］。總之，TBK1對PH患者巨噬細胞中的脂肪酸氧化可能有一定影響，但其具體機制有待進一步研究。

5 TBK1在PH患者肺血管系統ECM重塑中的作用

越來越多的證據表明，肺動脈ECM重塑導致的肺動脈順應性降低在PH發病中起關鍵作用［4］。研究發現，PH大鼠表現出典型的NF-κB活性增加，同時伴有右心室肥厚和右心功能障礙，而給予非選擇性NF-κB抑制劑可以改善這種狀況［69］。這可能與ECM重塑有關，PH患者的ECM重塑可歸因于內皮-間充質轉分化（endothelial-mesenchymal transition，EndoMT），其中內皮細胞可獲得間充質表型，其基因譜表達增加，類似于平滑肌細胞［70］。通常與PH發病機制有關的各種因素會引發EndoMT，如慢性缺氧導致的轉錄因子Snail、Twist、信號轉導、活化轉錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、NF-κB、IRF1和β-catenin表達增加，這些轉錄因子通過與HIF和TGF-β信號傳導相互作用來引發EndoMT［70-71］。同時研究發現，在PH動物模型及內皮細胞模型中，NF-κB家族成員（如NF-κB1、NF-κB2、P65和RelB）的DNA結合活性均增加［72］。TBK1中的CCD2可與TANK、NAP1及與NAP1類似的TBK1接頭蛋白（similar to NAP1 TBK1 adaptor，SINTBAD）相結合，進而共同調控NF-κB信號通路的活化［73］。TBK1同時可以與NAP1直接相互作用，進而活化NF-κB信號通路［74］。綜上，在PH患者中，TBK1可通過活化NF-κB信號通路來影響EndoMT，進而導致肺血管系統ECM重塑。

6 小結及展望

PH存在病情進展迅速、致死率高、預后較差的特點，目前被稱為心血管疾病中的“惡性腫瘤”。當前治療藥物并不能逆轉已發生的肺血管系統ECM重塑，只能延緩PH的病情進展，且患者的長期預后依舊不容樂觀。TBK1參與的巨噬細胞中DAMP相關先天免疫、代謝異常及肺血管系統ECM重塑在PH病理過程中發揮了重要作用，抑制TBK1可有效緩解PH，進一步明確TBK1在PH發展過程中的分子機制可為治療PH提供新的思路。

作者貢獻：劉美洋進行文獻資料的收集和分析，撰寫、修訂論文；孫佳偉、崔志峰進行文獻資料的分析、整理；宮小薇、袁雅冬進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制和審校；袁雅冬對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。