絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1在放射性肺纖維化中的作用及其機制研究

張旭濤，張遷，2，王瀚，王斌，2，劉峰舟，2，吳侃，阮柏，張敏，王小成，2

放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）是臨床上胸部腫瘤放療后常見的一種嚴重并發癥［1］，其特點是肺組織內成纖維細胞持續活化，過度分泌膠原等細胞外基質（extracellular matrix，ECM），對肺組織造成不可逆破壞及導致肺功能惡化，最終導致患者呼吸衰竭甚至死亡［2］。研究表明，在RIPF發生過程中巨噬細胞發揮了重要作用，在放射性肺損傷前期即放射性肺炎階段巨噬細胞以M1型極化為主，而在放射性肺損傷后期即RIPF階段巨噬細胞以M2型極化為主［3］。M2型巨噬細胞可分泌轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），從而刺激成纖維細胞活化，這是誘發RIPF的關鍵因素［4］。本課題組前期構建了一種新型抗纖維化多肽Ac-SDDKDP，發現其能夠通過抑制絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1（serine/arginine rich protein specific kinase 1，SRPK1）磷酸化來發揮抗肝纖維化、特發性肺纖維化的作用［5］，但SRPK1與組織纖維化之間的關系尚不明確，SRPK1在RIPF中的作用亦不清楚。因此，本研究以SRPK1為突破口，重點研究SRPK1在RIPF中的作用及其機制，以期為RIPF的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年3月至2022年2月。

1.2 實驗動物 2月齡C57BL/6J雌性小鼠30只，平均體質量（20.2±8.1）g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心。所有小鼠飼養在空軍軍醫大學實驗動物中心，且符合空軍軍醫大學實驗動物飼養條件，環境溫度保持26 ℃，濕度為50%，噪聲控制在60 dB以下，常規飼料飼養，飼養間的光照強度控制在15～20 LX，明暗交替為12 h/12 h。本研究通過空軍軍醫大學倫理委員會批準。

1.3 實驗材料 水合氯醛、4%多聚甲醛購自西安科昊生物工程有限責任公司，SRPIN340購自上海陶素生物科技有限公司，蘇木素染色液、伊紅染色液、ELISA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，Masson試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司，羥脯氨酸試劑盒、CD45、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、SRPK1、α平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）購自英國Abcam公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及干預方法 將30只小鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，各10只。對照組小鼠不進行干預；模型組和干預組小鼠均構建RIPF模型，具體方法為：采用水合氯醛麻醉小鼠，采用鉛板遮擋小鼠頭部和腹部，僅保留胸部位置，進行X射線輻照，照射總劑量為17.5 Gy，劑量率為1.9 Gy/min［6］。建模成功后干預組小鼠腹腔注射SRPK1抑制劑——SRPIN340，800 μg·kg-1·次-1，3次/周；模型組小鼠給予相同劑量的PBS；兩組均干預16周，其中模型組小鼠死亡5只，干預組死亡3只。干預結束后，處死各組小鼠并收集其全肺組織及肺泡灌洗液。

1.4.2 HE染色觀察小鼠肺組織結構 取各組小鼠全肺組織，PBS沖洗后采用4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣，常規石蠟包埋，并將包埋標本切成4 μm的薄片，依次進行石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封固操作，采用顯微鏡隨機選取10個不重疊的視野，放大20倍，觀察肺組織結構。

1.4.3 Masson染色觀察小鼠肺組織ECM沉積情況 取各組小鼠肺組織進行石蠟包埋、切片，隨后進行脫蠟處理；切片依次用蒸餾水和去離子水進行沖洗，按照試劑盒說明書進行Masson染色：切片常規脫蠟、至水，核染液染色1 min，沖洗液沖洗30 s；質染液染色10 s，沖洗液沖洗30 s；分化液分色8 min；棄去分色液后直接用復染液染色3 min，采用100%乙醇溶液洗凈浮色，二甲苯透明，中性樹膠封固；采用顯微鏡隨機選取10個不重疊的視野，放大20倍，觀察肺組織藍色染色區域情況即ECM沉積情況。

1.4.4 羥脯氨酸試劑盒檢測小鼠肺組織羥脯氨酸水平稱取各組小鼠肺組織100 mg，置于安瓿瓶，加入2.5 ml純水和2.5 ml濃鹽酸封瓶，置于105 ℃烘箱中水解18 h，采用濾紙過濾獲得肺組織水解液。取10 μl肺組織水解液，加入10 μl內標溶液（10 mg/L），用72%乙腈水溶液定容至10 ml；取稀釋液1 ml，15 000×g離心10 min，取上清液，采用羥脯氨酸試劑盒檢測羥脯氨酸水平。

1.4.5 ELISA檢測小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平 取各組小鼠肺泡灌洗液，用包被緩沖液稀釋抗原至最適宜濃度（15 μg/ml），在微反應板每個凹孔中分別滴加0.3 ml溶液；在每個凹孔中加入用含有0.05%吐溫的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0.2 ml，于37 ℃下作用1.5 h；在每個凹孔中加入稀釋緩沖液稀釋的酶結合物0.2 ml，于37 ℃下作用1.5 h；在每個凹孔中加入底物溶液0.2 ml，室溫作用30 min；在每個凹孔中加入2 mol/L的H2SO4或2 mol/L的枸櫞酸0.05 ml。用酶標比色計測定450 nm處的OD值，即IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平。

1.4.6 免疫熒光法檢測小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數 取各組小鼠肺組織，吸去組織液，用PBS洗2次；加入4%多聚甲醛，固定15 min；用PBS洗3次，5 min/次；加入0.3% TritonX-100破膜15 min；用PBS洗3次，5 min/次；加入5% BSA封閉液室溫封閉30 min；用PBS洗3次，5 min/次；按1∶400的比例用PBS稀釋CD45抗體，于4 ℃孵育過夜；用PBS洗3次，5 min/次；按1∶150的比例用PBS稀釋FITC標記的二抗，室溫孵育2 h；用PBS洗3次，5 min/次；加入DAPI孵育5 min，進行細胞核染色；用PBS洗3次，5 min/次。用共聚焦顯微鏡拍攝圖像，采用Image J軟件分析CD45+T淋巴細胞計數。

1.4.7 免疫組化法檢測小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平 取各組小鼠肺組織進行石蠟包埋、切片，依次進行脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、復染細胞核、脫水封固及顯微鏡鏡檢拍照等操作，采用Image J軟件計算累積光密度，即Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織結構 HE染色結果顯示，對照組小鼠肺組織結構完整，肺泡結構清晰可見；模型組小鼠肺組織出現明顯的損傷和結構紊亂，肺泡壁增厚扭曲，可見大量病灶形成；干預組小鼠肺組織出現輕微損傷，肺組織結構較模型組完整，肺泡壁增厚現象減少，見圖1。

圖1 HE染色觀察各組小鼠肺組織結構（×20）Figure 1 The lung tissue structure of mice in each group observed by HE staining

2.2 肺組織ECM沉積情況 Masson染色結果顯示，對照組小鼠肺組織僅見少量ECM沉積；模型組小鼠肺組織中出現大量ECM沉積；與模型組相比，干預組小鼠肺組織ECM沉積明顯減少，見圖2。

圖2 Masson染色觀察各組小鼠肺組織ECM沉積情況（×20）Figure 2 Deposition of ECM in lung tissue of mice in each group observed by Masson staining

2.3 肺組織羥脯氨酸水平 對照組、模型組、干預組小鼠肺組織羥脯氨酸水平分別為（512.7±165.2）、（1 765.4±432.1）、（987.0±231.6）μg/mg。三組小鼠肺組織羥脯氨酸水平比較，差異有統計學意義（F=37.920，P＜0.001）；模型組、干預組小鼠肺組織羥脯氨酸水平高于對照組，差異有統計學意義（t值分別為8.696、3.292，P值分別為＜0.001、0.004）；干預組小鼠肺組織羥脯氨酸水平低于模型組，差異有統計學意義（t=5.403，P＜0.001）。

2.4 肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、干預組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較（±s，pg/ml）Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-8，IL-13 and TGF-β1 in the bronchoalveolar lavage fluid of mice in the three groups

表1 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較（±s，pg/ml）Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-8，IL-13 and TGF-β1 in the bronchoalveolar lavage fluid of mice in the three groups

注：TGF-β=轉化生長因子β；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 IL-6 IL-8 IL-13 TGF-β1對照組 10 32.4±7.7 73.6±10.0 37.0±7.5 298.0±102.4模型組 5 123.6±9.0a209.8±11.3a164.6±9.1a2 756.2±327.7a干預組 7 65.5±9.5ab107.9±16.4ab74.0±8.0ab1 543.0±167.6ab F值 189.758 199.892 427.165 288.245 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 肺組織CD45+T淋巴細胞計數 對照組、模型組、干預組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數分別為（5.84±0.12）、（27.54±7.96）、（13.96±2.64）個/mm3。三組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數比較，差異有統計學意義（F=50.601，P＜0.001）；模型組、干預組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數高于對照組，差異有統計學意義（t值分別為10.048、3.760，P值分別為＜0.001、0.001）；干預組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數低于模型組，差異有統計學意義（t=6.288，P＜0.001），見圖3。

圖3 免疫熒光法檢測各組小鼠肺組織CD45+ T淋巴細胞計數（免疫熒光染色，×20）Figure 3 The number of CD45+ T lymphocytes in lung tissue of mice in each group detected by immunofluorescence

2.6 肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1表達水平高于對照組、低于模型組，α-SMA表達水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of Arg-1，SRPK1 and α-SMA in the lung tissue of mice in the three groups

表2 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of Arg-1，SRPK1 and α-SMA in the lung tissue of mice in the three groups

注：Arg-1=精氨酸酶1，SRPK1=絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1，α-SMA=α平滑肌肌動蛋白；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 Arg-1 SRPK1 α-SMA對照組 10 6.3±1.9 5.6±0.4 8.3±2.6模型組 5 28.9±8.5a 38.9±3.6a 31.0±14.9a干預組 7 19.1±6.4ab 12.7±8.6ab 17.4±8.8b F值 30.445 72.629 11.617 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.001

3 討論

RIPF是一種腫瘤放療嚴重并發癥，嚴重者常危及患者生命，是造成患者預后差甚至發生非原發病死亡的主要原因之一［7］。腫瘤患者放療時輻射可誘發肺組織內成纖維細胞持續活化并過度分泌膠原等ECM，造成肺組織發生不可逆損傷，甚至導致患者死亡。目前RIPF發生發展的機制尚不清楚，且沒有明確的治療靶點和臨床治療藥物，因此闡明RIPF的具體發生機制，對RIPF的防治具有重要意義。本課題組前期研究發現，Ac-SDDKDP能夠通過抑制SRPK1磷酸化來發揮抗肝纖維化作用［5］，但SRPK1與組織纖維化之間的關系尚不明確，SRPK1在RIPF中的作用亦不清楚。本研究旨在分析SRPK1在RIPF中的作用及其機制。

本研究HE染色結果顯示，模型組小鼠肺組織出現明顯的損傷和結構紊亂，肺泡壁增厚扭曲，可見大量病灶形成；干預組小鼠肺組織出現輕微損傷，肺組織結構較模型組完整，肺泡壁增厚現象減少。Masson染色結果顯示，模型組小鼠肺組織中出現大量ECM沉積；與模型組相比，干預組小鼠肺組織ECM沉積明顯減少。提示抑制SRPK1表達可以減輕RIPF模型小鼠肺組織損傷和纖維化程度。本研究結果還顯示，模型組、干預組小鼠肺組織羥脯氨酸水平高于對照組，干預組小鼠肺組織羥脯氨酸水平低于模型組，提示抑制SRPK1表達可有效抑制羥脯氨酸表達，進而抑制膠原的過度分泌。纖維化的發生伴隨著慢性炎癥的長期刺激，IL-6、IL-8、IL-13是主要的引起纖維化的炎性因子［8］，而CD45是炎性細胞白細胞的表面標志物，且CD45+T淋巴細胞越多說明炎癥程度越嚴重［9］。本研究結果顯示，模型組、干預組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13水平高于對照組，干預組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13水平低于模型組；模型組、干預組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數高于對照組，干預組小鼠肺組織CD45+T淋巴細胞計數低于模型組，提示抑制SRPK1表達可以減輕RIPF模型小鼠的炎性反應。上述結果均提示SRPK1與RIPF的發生密切相關，但其相關調控機制并不明確。

巨噬細胞作為機體主要的炎癥效應細胞，與RIPF的形成密切相關［10］。巨噬細胞經不同刺激可分別向M1型和M2型極化［11］，二者在機體中發揮不同作用。在內毒素刺激下巨噬細胞可向M1型極化，釋放大量促炎因子而發揮促炎作用［12］。在IL-6、IL-13等作用下巨噬細胞可向M2型極化［13］，M2型巨噬細胞是RIPF發生過程中重要的效應細胞［14］，其可分泌大量Arg-1、TGF-β1等細胞因子，其中Arg-1是M2型巨噬細胞活化的標志物，TGF-β1是成纖維細胞活化的關鍵因子，是肺纖維化形成的關鍵因素［15］。因此，抑制肺組織內巨噬細胞向M2型極化，能夠減少Arg-1、TGF-β1的持續分泌，抑制成纖維細胞的活化，減少肺組織內ECM的沉積。成纖維細胞激活是造成肺組織纖維化的終端因素，而α-SMA是成纖維細胞激活的標志［10］。本研究結果顯示，模型組、干預組小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1水平高于對照組，干預組小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1水平低于模型組；模型組小鼠肺組織Arg-1、α-SMA表達水平高于對照組；干預組小鼠肺組織Arg-1表達水平高于對照組、低于模型組，α-SMA表達水平低于模型組；提示抑制SRPK1表達可以抑制巨噬細胞向M2型極化，進而緩解RIPF的進展。以上研究結果提示SRPK1通過促進巨噬細胞向M2型極化激活成纖維細胞，從而發揮促纖維化作用，但SRPK1是如何促進巨噬細胞向M2型極化的尚不清楚，這將是下一步研究的重點。

綜上所述，SRPK1可促進RIPF的發生發展，其可能機制為SRPK1促進肺組織內巨噬細胞向M2型極化，激活成纖維細胞，進而促進肺纖維化。但本研究僅揭示了SRPK1與M2型巨噬細胞的關系及其在RIPF中發揮的作用，并未深入研究SRPK1調控巨噬細胞向M2型極化的具體機制。

作者貢獻：張旭濤、王小成進行文章的構思與設計；張旭濤進行研究的實施與可行性分析，撰寫論文；張遷進行數據收集；王瀚進行數據整理；王斌進行統計學處理；劉峰舟進行結果的分析與解釋；張旭濤、吳侃、阮柏進行論文的修訂；張敏、王小成負責文章的質量控制及審校；王小成對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。