嬰幼兒配方乳粉中OPO的快速檢測

沈祥震，張然，明雙喜，劉偉，高偉偉，楊穎*

山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）

嬰幼兒配方乳粉作為一種比較理想的母乳替代品[1]，能有效地為一些無法正常母乳喂養的嬰幼兒提供生長發育所需的能量和營養物質。母乳中含有3.0%～4.5%的脂肪，其中甘油三酯含量占其總脂肪酸含量的98%左右[2]。人體代謝甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸占代謝產物總量的60%～70%[3-4]，1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）作為一種典型的Sn-2棕櫚酸酯，可與膽汁鹽形成乳糜微粒，促進脂肪和鈣的吸收，增加骨骼礦物質含量和預防嬰幼兒便秘[5-7]。

近年來，越來越多的國內外大型嬰幼兒配方乳粉生產企業以嬰幼兒配方奶粉中添加OPO為主要賣點進行宣傳，雖然食品營養強化劑使用標準中規定OPO在嬰幼兒配方乳粉中的添加量[8]，但國內尚未發布任何關于OPO的檢測標準。關于1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的檢測方法主要有薄層色譜分離法[9]、正向液相色譜法[10]、固相萃取分離與氣相色譜-質譜聯用法[11]、氣相色譜-質譜聯用法[12-13]和氣相色譜法[14-15]。經實際試驗發現上述檢測方法在經濟性、實用性和準確性等方面不能滿足日常檢驗的需求。因此，試驗探索一種以酸水解法處理樣品，用乙醚石油醚混合溶液提取嬰幼兒配方乳粉中的OPO，旨在獲得一種準確度和精密度良好、無需添加內標、環境友好、操作簡單、準確可靠的快速分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀[島津2030型，配有電子捕獲檢測器（FID），日本島津公司]；鹽酸、乙醇、乙醚、石油醚（分析純）；正己烷（色譜純）；氮氣（N2，純度≥99.9%）；標準品1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（加拿大TRC公司）；試驗用超純水（由Millipore Milli-Q系統凈化蒸餾水獲得）。

1.2 色譜條件

毛細管色譜柱（100%二甲基聚硅氧烷耐高溫色譜柱，柱長15 m，內徑0.25 mm，膜厚0.1 μm）；檢測器溫度300 ℃；載氣采用氮氣；恒線速度模式33.1 cm/s；進樣口溫度300 ℃。程序升溫：100 ℃，保持3 min，以15 ℃/min的速率升溫至380 ℃，保持10 min。進樣方式采用分流進樣；分流比20∶1；進樣體積1.0 μL。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取10 mg 1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標準品，加入適量正己烷使之溶解，并于10 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，得到1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標準儲備液；以標準儲備液分別配制質量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20和0.50 mg/mL的標準溶液。

1.4 試驗方法

將0.5 g嬰幼兒配方乳粉在5 mL溫水中溶解（液體乳直接稱取5 g樣品），溶解后加入1 mL鹽酸，于65±2 ℃的水浴鍋中水解40 min，水解后冷卻至室溫，加入7 mL乙醇混合均勻，加入20 mL乙醚和石油醚等體積混合溶液，渦旋提取1 min，靜置20 min后離心，取上層有機相作為提取液，下層水相重復提取1次，合并有機相并定容至50 mL，取2 mL提取溶液于40 ℃水浴中氮吹吹干，用正己烷溶解并定容至5 mL，得待測樣品溶液。

1.4.1 水解方式的選擇

取2組乳粉樣品，經充分溶解后，分別加入1 mL鹽酸和4 mL氨水進行水解，設置6組平行試驗，考察不同水解方法對OPO提取效果的影響。

1.4.2 乙醇加入量對OPO提取效果的影響

取不同試驗組，分別加入0，2，5，10和15 mL無水乙醇，考察不同乙醇加入量對OPO提取效果的影響。

1.4.3 不同提取溶劑對OPO提取效果的影響

結合GB 5413.3—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》中脂肪的提取方法以及1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯易溶于烷烴類溶劑的特性，選取乙醚石油醚等體積混合溶液、正己烷和正庚烷3種提取溶劑進行比較分析。

1.4.4 溶劑使用量及提取次數對OPO提取效果的影響

將待測樣品分為4組，分別為①②③④，每組樣品3個平行，組①中待測樣品經水解并加入乙醇后，加入10 mL乙醚渦旋提取2 min，加入10 mL石油醚渦旋提取2 min，靜置分層后將有機層取出至100 mL容量瓶中，水相重復上述提取步驟進行第2和第3次提取，合并有機相至100 mL容量瓶中，并用乙醚石油醚等體積混合溶液定容至刻度，準確移取5 mL有機相提取液，氮吹至干后以5 mL正己烷復溶，待上機。組②以體積比1∶1的乙醚+石油醚混合溶液作為提取溶劑，待測樣品經水解并加入乙醇后，加入20 mL體積比1∶1的乙醚+石油醚混合溶液，渦旋提取2 min，靜置分層后將有機層取出至100 mL容量瓶中，水相重復上述提取步驟進行第2和第3次提取，合并有機相至100 mL容量瓶中并用乙醚石油醚等體積混合溶液定容至刻度，準確移取5 mL有機相提取液，氮吹至干后以5 mL正己烷復溶，待上機。組③同組②，只不過不再進行第3次提取。組④也同組②，但只進行第1次提取。對溶劑使用量及提取次數進行優化分析。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

2.1.1 水解方式的選擇

取2組乳粉樣品，經充分溶解后，分別加入1 mL鹽酸和4 mL氨水進行水解，考察不同水解方法對OPO提取效果的影響，設置6組平行試驗，結果見表1。

表1 不同水解方法對OPO提取效果的影響

由表1可以看出，酸水解法的提取效率和精密度均優于堿水解法。由于乳制品中的脂類多以結合態脂肪球形式存在，而脂肪球的周圍有一層膜以使脂肪球在乳中保持穩定，采用一定濃度的酸或氨水使非脂成分溶解，乳中酪蛋白鈣鹽轉變成可溶性蛋白或蛋白銨鹽，脂肪球膜被軟化破壞，從而使結合態的脂類得以游離出來。

使用鹽酸水解法水解更徹底，加入有機試劑提取時在有機相與水相分層的界面處會形成一個蛋白質水解物的白色薄膜，使分層更為明顯（圖1b）；而堿水解法由于水解不夠充分，加入有機試劑提取時在有機相與水相分層的界面處會形成一定厚度的乳化層（圖1a），不利于試驗的進行。

圖1 不同水解方式對OPO提取效果的影響

2.1.2 乙醇加入量對OPO提取效果的影響

樣品經水解后加入不同量的乙醇溶液，考察不同乙醇加入量對OPO提取效果的影響，試驗結果見圖2。

由圖2可以看出，乙醇加入量5～10 mL能達到較為理想的提取效果。待測樣品經酸水解后加入一定量的乙醇溶液，一方面使能溶于乙醇的物質進入水相，減少一些非脂成分進入有機層；另一方面能促使樣品中的蛋白質變性沉淀，不易產生乳化。綜合考慮試驗成本及提取效果，試驗采用7 mL乙醇進行提取。

2.1.3 提取溶劑的選擇

由圖3可以看出，在選取乙醚石油醚等體積混合溶液作為提取溶劑時，對樣品中OPO的提取效率明顯優于正己烷和正庚烷組。乙醚具有較強的溶解脂類物質的能力，除此之外還能溶解游離脂肪酸、醇、磷脂及色素等脂溶性物質。石油醚不溶于水，能溶解脂肪、游離脂肪酸，不易溶解醇、磷脂和色素。使用乙醚石油醚等體積混合溶液作提取溶劑時，石油醚的加入能有效降低乙醚的極性，促進乙醇進入水層，使溶于水相的部分乙醚被競爭出來，從而使有機相與水相更好分層。

圖3 提取溶劑對OPO提取效果的影響

2.1.4 溶劑使用量及提取次數對OPO提取效果的影響

由圖4可以看出，對比組①和組②可以看出，乙醚和石油醚分步提取與乙醚石油醚等體積混合溶液提取2種提取方式對樣品中OPO提取效率的影響無顯著性差異。對比組②，組③和組④可以看出，使用乙醚石油醚等體積混合溶液提取2次即能達到較為理想的提取率。故試驗選用乙醚石油醚等體積混合溶液作為提取溶劑，提取次數為2次。

圖4 提取體積及提取次數對樣品中OPO提取效果的影響

2.2 方法的考察

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限

試驗以不添加OPO的乳粉樣品為基質，按1.3的方法進行處理得到質量濃度0.01，0.02，0.05，0.1，0.20和0.50 mg/mL的標準溶液，按1.2的分析方法測定，采用外標法定量。以峰面積為縱坐標（y），目標物的質量濃度為橫坐標（x，mg/mL）繪制基質標準曲線。

結果表明，OPO在0.01～0.5 mg/mL范圍內具有較好的線性關系，標準工作曲線的線性方程為Y=553 441X-1 264.9，相關系數為0.999 4，試驗中以所得到的3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，以所得到的10倍信噪比（S/N=10）計算定量限，方法的檢出限和定量限分別為0.06 g/100 g和0.2 g/100 g。該方法可滿足乳制品中OPO含量分析的要求。

圖5 標準品工作液及樣品提取液色譜圖

2.2.2 精密度試驗

通過上述方法對同一添加OPO的嬰幼兒乳粉樣品進行6次平行試驗，計算出OPO的含量，結果見表2。

由表2可知，相對標準偏差SRSD=0.704%，表明其精密度良好。

表2 同一嬰幼兒乳粉中OPO含量的測定

2.2.3 加標回收率試驗

在0.2，2.0和10.0 g/100 g這3個添加水平下，樣品的回收率分別為98.6%，96.4%和101.5%，表明測定結果均具有良好的重現性。

3 結論

以酸水解法對樣品溶液進行水解后，用乙醚、石油醚等體積混合溶劑提取脂肪，可將嬰幼兒配方乳粉中的脂肪酸充分提取，利用毛細管色譜柱以程序升溫的方式對目標化合物進行分離，氫火焰離子化檢測器（FID）檢測，實現1, 3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯同分異構體的分離。該方法方便、快捷，定性準確，重復性較好，可用于嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的實驗室快速批量檢測。