血紅蛋白氧載體的研究與應用進展

李 菂，韓樾夏，楊 芳

(1. 東南大學生物科學與醫學工程學院 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210096)(2. 中國科學院空間應用工程與技術中心，北京 100094)

1 前 言

氧在自然界中分布非常廣泛，更是生命之源。對于生物與醫療來說，許多病癥均伴隨著氧氣的缺乏，因此不斷開發與更新性能良好的醫用載氧材料成為熱門的研究課題。血紅蛋白來源于生物體本身，作為紅細胞的主要組成部分，依靠分子中心的鐵原子承擔機體氧氣運輸的功能，在攜氧能力、安全性或生物相容性方面，均具有獨特的優勢。由此，以血紅蛋白為基礎的氧載體在生物醫學領域的相關研究應運而生。血紅蛋白氧載體通常由血紅蛋白加以化學修飾，或由多種材料組成的膜殼結構包封構成，應用于多種由于缺氧引起或呈現乏氧癥狀的疾病的治療。如圖1所示，本文對近年來血紅蛋白氧載體的制備研究與臨床應用進展進行綜述。

圖1 血紅蛋白氧載體構建與應用示意圖Fig.1 Construction and application of hemoglobin oxygen carrier

2 血紅蛋白的化學修飾

血紅蛋白因其對氧的攫取和運載能力而成為人工氧載體的良好選擇。然而，裸露在血液中的血紅蛋白容易被人體固有免疫系統識別并迅速清除。且游離于血液中時，血紅蛋白分子中的2對珠蛋白鏈構成的四聚體極易降解為二聚體，使其不僅失去載氧功能，而且產生腎毒性[1, 2]，危害人體健康。為了克服這一問題，研究者需要對血紅蛋白氧載體進行表面化學修飾或包封，以保證安全性與良好的攜氧能力，從而延長循環時間，提高載氧效率。在化學修飾層面，多使用偶聯、交聯或物理吸附等方式增加血紅蛋白的穩定性。

2.1 氧化葡聚糖修飾血紅蛋白

Hickey等[3]通過控制乙醇的濃度沉淀血紅蛋白，合成了粒徑約為250 nm的去溶劑化血紅蛋白納米顆粒，如圖2所示，其以氧化葡聚糖作為有效的表面穩定劑，保持粒子的完整性，改善了普通聚合血紅蛋白材料顆粒大小和形狀不均勻等缺點。Kloypan等[4]也進行了氧化葡聚糖交聯血紅蛋白的制備研究，該材料溶血率低，不影響白細胞的吞噬功能，也不會引起血小板的活化，因此具有良好的血液相容性，是很有前景的氧氣及藥物載體。氧化葡聚糖的修飾步驟相對簡單，雖然在材料攜氧量上不具有附加優勢，但可基本維持血紅蛋白的化學穩定性，并規避體內屏障，保障順利運氧。

圖2 去溶劑化血紅蛋白納米顆粒合成示意圖[3]Fig.2 Synthesis schemitc of desolvent hemoglobin nanoparticles[3]

2.2 戊二醛多聚血紅蛋白

Gu等[5]制備了具有不同交聯密度的超高分子量(>500 kDa)的結合氧氣(松弛態，R態)或未結合氧氣(緊張態，T態)的戊二醛聚合牛血紅蛋白(PolybHbs)，如圖3所示，其均具有良好的攜氧能力，其中T態PolybHbs的氧氣卸載速率明顯更高。Belcher等[6]嘗試了氣體交換和試劑添加的控制方法，采用完全耦合的小型切向流超濾系統對合成的聚合人血紅蛋白(PolyhHb)分子進行純化和濃縮，從而更精確地控制PolyhHb分子的尺寸、形貌及其分散性，保留其攜氧能力、氧親和力和氧卸載特性。戊二醛多聚血紅蛋白可根據應用要求調節聚合物分子量大小，從而調節材料的氧親和力，聚合產物分子量越高，氧親和力越強；但其缺點是導致血紅蛋白自氧化性能增加[7]，使部分血紅蛋白失去攜氧能力。

圖3 T態和R態聚合牛血紅蛋白合成示意圖[5]Fig.3 Synthesis schematic of T-and R-state PolybHb [5]

2.3 有機基團共軛血紅蛋白

早在1983年，Iwashita等[8]通過酰胺鍵將血紅蛋白分別與聚乙二醇、聚丙二醇以及環氧乙烷和環氧丙烷等聚合物共價偶聯，研制出一類含血紅蛋白或血紅蛋白衍生物的有機聚合物載氧材料。1986年，Iwasaki等[9]則公開發布了其血紅蛋白的化學修飾結構，通過聚環氧乙烷的端基和血紅蛋白的氨基之間的鍵結合，形成—CH2—O—CH2—CONH—Hb的結構。Christoforidis等[10]研制了牛源聚乙二醇化碳氧血紅蛋白為基礎的氧載體，用以向缺氧組織釋放氧。該氧載體可在軟腦膜小動脈血管舒張、抗腫瘤和抗炎等方面發揮作用，并可向嚴重缺氧組織輸送氧氣，在減緩急性腦卒中缺血性損傷方面顯示出良好的應用前景。

2.4 血紅蛋白與其他材料結合

Prapan等[11]通過2次、3次沉淀法對人血清白蛋白、透明質酸和丙氨酸進行了表面吸附研究，結果表明，不同表面修飾的血紅蛋白亞微米顆粒不僅會影響氧的結合能力，還會影響對抗血紅蛋白抗體、免疫球蛋白和觸珠蛋白的結合。Xia等[12]將金納米粒子血紅蛋白復合物納米粒子負載于血小板上(Au-Hb@PLT)，如圖4所示，這些Au-Hb@PLT體積小，能使金納米粒子血紅蛋白復合物深入腫瘤組織，作為放射增敏劑來增強腫瘤細胞對X射線的敏感性，同時血紅蛋白作為氧載體來緩解缺氧，從而增強低劑量放療的治療效果。將血紅蛋白聯合各類材料，在應用層面除可以更精確地調節釋氧量外，也可進行病灶靶向聯合其它療法進行治療，使血紅蛋白載體材料功能更豐富，更有針對性。

圖4 Au-Hb@PLT材料合成示意圖[12]Fig.4 Synthesis schematic of Au-Hb@PLT[12]

3 血紅蛋白的微囊封裝技術

為進一步提高血紅蛋白氧載體的攜氧能力并增加載體功能，研究者運用多種材料制備膜殼結構，封裝血紅蛋白,形成尺度為微納級別的囊泡，構成更加穩定和多元的氧運載系統。微囊封裝的方式不僅增加了血紅蛋白包封率，更使血紅蛋白內核的功能得以完善保留。與此同時，不同膜殼材料本身的分子特性豐富了微囊載體的功能，并且可以提升其生物相容性，以適應更為復雜的生物環境，使血紅蛋白氧載體擁有更廣泛的應用前景。

3.1 脂質體包載血紅蛋白

Arifin等[13]研究了脂質體包裹的四聚血紅蛋白分散體，其通過擠壓的方式制備而成，膜殼使用物質的量的比為10∶9∶1的二嘧磺酰磷脂酰膽堿、膽固醇和二嘧磺酰磷脂酰甘油的脂質混合物，具有較高的血紅蛋白包封效率、較低的高鐵血紅蛋白水平，以及較好的氧結合特性。Awasthi等[14]則使用聚乙二醇二硬脂酰磷酸酯酰乙醇胺作為脂質體包封膜殼，以中性或負電荷的血紅蛋白為載體。聚乙二醇降低了網狀內皮系統對血紅蛋白載體材料的截留，從而降低其肝臟攝取率，而增加了脾臟攝取率。聚乙二醇化的材料設計不僅提高了囊泡內血紅蛋白的含量，同時改善了血紅蛋白載體在循環系統內的傳輸作用，為后續應用提供了更多可能。Li等[15]則繼續引入肌動蛋白基質，制備了脂質體包裹的肌動蛋白-血紅蛋白的分散體。相比單純的聚乙二醇化血紅蛋白的循環特性，增加肌動蛋白基質將進一步延長氧載體的循環半衰期，從而拓展了脂質體包裹血紅蛋白氧載體的應用前景。同時，脂質體由于磷脂分子的雙親性特質，賦予了材料更加多元化的載藥方向，也根據粒徑和包載形式的不同而具有不同的體內分布特性，并且具有更高的生物相容性。

3.2 聚合物囊泡包載血紅蛋白

Arifin等[16]將牛血紅蛋白包封在聚丁二烯-聚乙二醇(PBD-PEO)聚合物囊泡中，構成兩親性多聚體包裹血紅蛋白的分散體。與傳統脂質體相比，該聚合物囊泡具有更長的PEG鏈和更厚的疏水膜，其血紅蛋白載量也高于脂質凝膠包裹的血紅蛋白顆粒和納米水凝膠包裹的血紅蛋白顆粒。囊泡平均半徑大于50 nm，氧親和力與人紅細胞相當，可以發展成為一種有效的氧療法。Rameez等[17]開發了由聚環氧乙烷(PEO)、聚己內酯(PCL)和聚丙交酯(PLA)組成的兩親性二嵌段共聚物自組裝包裹血紅蛋白的材料。在兩親性二嵌段共聚物中，PEO作為親水性嵌段，而PCL或PLA則可作為疏水性嵌段；其中PCL和PLA可生物降解，而PEO、PCL和PLA均是生物相容性聚合物。因此該材料具有可生物降解和生物相容性，血紅蛋白負載能力較好。聚合物囊泡包裹的血紅蛋白氧載體攜氧性能良好，且在體內的循環時間延長，作為治療性氧載體具有良好前景。

4 血紅蛋白氧載體的治療應用

血紅蛋白氧載體的應用范圍非常廣泛，如作為細胞培養添加劑，可提升細胞增殖率、增強細胞活力等[18]。而在臨床上，許多疾病是由缺氧引起的，由適合的氧載體遞送氧氣常常可以直接減輕癥狀。雖然輸血技術在今天已經逐步趨于安全和完善，但相比于輸血，運用人工氧載體進行輸氧具有不可替代的優勢，例如氧載體與所有血型的相容性、避免交叉配血、可用性高、感染風險低等，并且能夠滿足長期儲存的需要。以血紅蛋白為基的氧載體正在作為一種“氧橋”，取代或補充標準輸血在危及生命的極端狀況下的需要，例如在偏遠地區、條件惡劣的戰場或患者由于宗教反對拒絕血液用品等。除此之外，很多伴隨癥狀出現的乏氧情況，也可以通過人工氧載體補充氧氣得以治療。而使用人工氧載體聯合化療或光動力療法等，更加速了治療的進程，具有非常可觀的應用前景。

4.1 紅細胞替代品

血紅蛋白氧載體作為紅細胞替代品的研發，40多年來已歷經3代，其修飾手段從化學修飾逐漸演變為封裝在合成膜中[19]。Jansman等[20]制備了聚丙交酯-乙交酯核(PLGA)，隨后用血紅蛋白和納米酶修飾。血紅蛋白被聚多巴胺包被，以保持蛋白質的結構和功能，如圖5所示。Romito等[21]使用聚乙二醇偶聯牛源碳氧血紅蛋白，在血液稀釋過程中可增加組織氧輸送并減少失血，適合等容血液稀釋，可在心臟手術的體外循環中更好地保存血液。Rubinstein等[22]將牛血紅蛋白氧載體HBOC-201運用于純紅細胞再生障礙性貧血(PRCA)的治療中。PRCA患者網織紅細胞絕對值減少，骨髓中紅細胞前體細胞缺失或嚴重減少。在接受HBOC-201治療后，患者出現了紅細胞計數恢復的跡象，加予免疫抑制治療，最終改善紅細胞生成。

圖5 不同功能組分吸附至聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)核合成示意圖[20]Fig.5 Synthesis of different functional components adsorbed to PLGA core[20]

4.2 心腦缺氧程度緩解

Ito等[23]將血紅蛋白載氧與局部冷灌注療法結合起來，對腦缺血再灌注損傷等產生更強的神經保護作用。他們在大鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型中，采用一種核殼結構的血紅蛋白-白蛋白簇與局部灌注進行聯合治療，灌注7 d后對神經功能缺損和梗死體積減少的療效顯著，腦血流減少、腦水腫和蛋白質外滲也有明顯改善，是一種對嚴重缺血性中風很有前景的神經保護策略。Gekka等[24]發現了血紅蛋白-白蛋白簇構成的氧載體顯著抑制缺氧及復氧處理細胞中活性氧的產生，具有良好的微血管灌注和氧輸送能力及可能的抗氧化作用，同樣對短暫性腦缺血具有神經保護作用。

4.3 惡性腫瘤治療

4.3.1 改善惡性腫瘤乏氧微環境

Jiang等[25]開發了一種由血紅蛋白聯合化療藥物卡巴唑構成的脂質體人工氧載體系統，能夠有效地向腫瘤輸送氧氣，并抑制腫瘤生長與轉移。該載體不僅能減輕腫瘤缺氧的程度，緩解腫瘤乏氧微環境，有效地將癌細胞滯留在腫瘤部位，而且能下調低氧誘導因子(HIF)的表達，有利于降低腫瘤的惡性程度。同時將血紅蛋白氧載體注入體循環，也可以通過緩解實體瘤缺氧情況的方式提高化療藥物的療效。Belcher等[26]設計了計算模型來模擬人體腫瘤結構，進行了聚合人血紅蛋白增強腫瘤氧合的模擬，以確定氧載體在腫瘤中的異質性血管結構下的潛在有效性。Belcher等[27]也研究對比了結合氧氣(松弛態，R態)和未結合氧氣(緊張態，T態)的聚合人血紅蛋白調節低氧(FME)和常氧(LOX)人黑色素瘤異種移植物中的氧輸送情況。通過對FME和LOX腫瘤異種移植物的生長率、血管和局部血流的觀察，輸注低氧親和力的T態血紅蛋白載體材料,從而使缺氧腫瘤組織氧合增加，血流量減少，血管生成減少，腫瘤生長減少。然而，輸注T態和R態的血紅蛋白載體材料在常氧性腫瘤中則并無改善。因此，腫瘤本身的氧氣狀態是輸注血紅蛋白氧載體材料的效用和結果的主要決定因素。因此，面對腫瘤治療，血紅蛋白氧載體類材料的研究更需要聚焦于乏氧微環境的靶向與調控，精準釋氧，以發揮最大效益。

4.3.2 光動力療法聯合治療

光動力療法因其無創性、副作用小等優點，已成為一種具有前瞻性與熱度的腫瘤治療方法。然而，腫瘤部位由于癌細胞的增殖而缺氧的內環境，嚴重阻礙了光動力療法的治療效果。因此，及時補充氧氣，提高活性氧的生成，可以有效輔助腫瘤的光動力治療。其中，依賴腫瘤內源性過氧化氫分解的原位制氧，并結合血紅蛋白或全氟化碳高載氧量的氧傳遞方式，成為光動力療法聯合治療的良好選擇。原位制氧技術對腫瘤具有很高的特異性，但其制氧效率受到腫瘤內過氧化氫水平的限制。與此相反，輸氧法雖然缺乏腫瘤特異性，但具有載氧效率高的優點。將血紅蛋白作為氧載體運載于脈管系統中，可以更高效和更具普適性地提升光動力療法的有效性。Zheng等[28]采用共沉淀法將血紅蛋白摻雜到碳酸鈣中，再將碳酸鈣交聯去除，得到血紅蛋白微粒，以吲哚菁綠(ICG)溶液孵育得到血紅蛋白/ICG顆粒(HbIPs)，并保持了載氧能力，比游離的ICG產生更多的活性氧，殺死比游離ICG多22%的癌細胞，很好地起到了補充光動力治療效果的作用。Luo等[29]通過二硫鍵重組將血紅蛋白和白蛋白進行雜交，同時包埋阿霉素，制備了腫瘤靶向性雜交蛋白氧載體，作為納米藥物用于精確的腫瘤氧合，同時聯合化療和光動力治療，提供更佳療效，如圖6所示。

圖6 腫瘤靶向性雜交蛋白氧載體合成示意圖[29]Fig.6 Synthesis schematic of Tumor targeted hybrid protein oxygen carrier[29]

4.4 缺血性休克與復蘇

失血過多是導致創傷或失血性休克患者死亡的主要原因，而目前用于急救的院前復蘇液提供的作用僅是糾正低血容量，保障有效的血輸出量和器官的血流灌注。

若材料可增加攜氧能力，則可減輕失血性休克時的微血管缺血和組織缺氧，對血液功能也是一種有效補充。William等[30]驗證了聚乙二醇化碳氧基團修飾的血紅蛋白的氧載體(PEG-COHb)對失血性休克大鼠全身及微循環的影響，證明PEG-COHb能有效改善心血管參數，降低乳酸含量，延長機體存活時間。同時復蘇后未檢測到高血壓，進一步支持了該載體材料對失血性休克癥狀緩解的效果。Philbin等[31]評價了HBOC-201對豬的合并軟組織損傷導致失血性休克的復蘇效果，該氧載體組別平均動脈壓、平均肺動脈壓和全身血管阻力指數較高，心臟指數、血流動力學和組織氧合恢復快，并減少了液體量需求，是一種效果較好的復蘇液體。

4.5 骨骼肌氧合

Horn等[32]研究發現無基質牛血紅蛋白溶液對骨骼肌組織氧合具有影響，該氧載體的治療有助于升高平均動脈壓和平均肺動脈壓并提高吸氧率，在嚴重動脈狹窄期間，增加氧攝取，改善骨骼肌組織氧合。Kawaguchi等[33]研究了高氧親和力的脂質體包裹血紅蛋白對骨骼肌人工輸送氧氣的作用。他們設計了大鼠快型跖肌(PLT)和慢型比目魚肌(SOL)原位抗疲勞試驗，原位分離PLT和SOL的遠端肌腱并分別連接到力傳感器上，記錄對同側坐骨神經刺激產生的張力。結果表明，該氧載體額外的氧氣供應可能會加速含有豐富線粒體的慢型有氧溶膠肌肉中的三羧酸循環與電子傳遞鏈，并有助于更快地去除如乳酸等的肌肉疲勞物質。

4.6 器官及肢體灌注

Bodewes等[34]提出使用血紅蛋白氧載體進行供體肝臟的離體機器灌注，以起到維持器官活力和細胞功能的關鍵作用。在心肌梗塞治療中，心肌缺血缺氧，可利用血紅蛋白氧載體保持毛細血管充分開放，使心肌得到有效灌注，使平均動脈壓升高，更大程度地加快氧的運輸[35]。George等[36]檢測并證明了血紅蛋白氧載體HBOC-201具有在急性、嚴重心肌缺血再灌注時減少梗死面積并提高心肌存活率的功效。Mahboub等[37]研究了腎臟逐漸復溫過程中以血紅蛋白氧載體代替簡單擴散碳流充氧的效果。該研究模擬了循環死亡腎移植后的供體，結果表明，在循環死亡的腎臟經歷從10到37 ℃的逐漸復溫過程中，與無氧復溫相比，使用血紅蛋白氧載體的組別呈現了良好的腎功能，超濾率增加，腎小球濾過率提高，鈉重吸收也有所改善。Aburawi等[38]則證明了合成血紅蛋白氧載體在人體腎臟常溫灌注中使用的可行性。Meur等[39]研究了細胞外血紅蛋白M101作為器官保存液添加劑對缺血及再灌注損傷的優勢，同時證實了M101的安全性。相比標準冷藏保存，離體常溫肢體灌注(EVNLP)方式保存下的肢體存活能力更好；而與無細胞灌注液相比，含有填充紅細胞的灌注液則可改善預后。但該灌注方式也具有局限性，包括可用性有限、交叉配血的需要、機械性溶血和促炎蛋白的激活等。Said等[40]對使用聚合牛血紅蛋白的氧載體HBOC-201制備EVNLP材料的可行性進行了研究，HBOC-201具有免疫原性低、無溶血反應危險、增強對流以及擴散氧傳遞等優點。通過豬前肢灌注，對結晶和破壞特征進行觀察，發現線粒體超微結構得到了更好的保存，肌肉收縮力也得到更好的保留。

5 結 語

近年來，研究者通過偶聯、交聯、吸附等各種方式進行化學修飾，以及利用脂質體、聚合物等各種材料進行微囊包埋，不斷研發和更新血紅蛋白氧載體，其應用多處于臨床研發階段，包含貧血、腦損傷、惡性腫瘤、缺血性休克、骨骼肌疲勞以及器官肢體灌注等方面，使傳輸和供給氧氣更加便捷和高效。血紅蛋白氧載體由于不存在完整的細胞結構，其釋氧速率快于天然紅細胞，需要進行表面修飾優化以達到緩釋的目的。未來血紅蛋白作為氧載體的研究可能會更加聚焦于開發更合適的包埋和修飾材料，使其理化性質更加穩定，更加適應瞬息萬變的機體環境；連接靶向物質，實現面對病灶的定向特異性供氧，使治療范圍更精準；聯合一氧化氮等材料，逆轉治療中的肺動脈高壓等情況，減輕血紅蛋白氧載體的不良反應，進一步提升治療的安全性。