慈蓮膠囊對增生乳腺組織凋亡通路的影響

劉彥恒 代志堅 張萌 李峰 夏瑤賓

【關鍵詞】乳腺增生;慈蓮膠囊;凋亡通路;修復

中醫學將乳腺增生病多稱為“乳癖”，多因情志不暢，肝氣郁結，氣滯不舒，氣血周流失度，氣滯血疲挾痰，導致乳絡經脈阻塞不通，結聚乳中為腫塊則引起乳房疼等癥候[1]。內蒙古自治區中醫醫院腫瘤科，觀察臨床發病率發現氣滯痰凝型居多，故在原經驗方“慈蓮丸”的基礎上加味調整，擬定并制備了中藥慈蓮膠囊，其以氣滯血疲痰凝為本，治療上重在疏肝行氣、化痰祛疲、散結止痛，同時佐以補腎調攝沖任，方中柴胡、青皮、丹參疏肝行氣、活血化疲為君，山慈菇、半枝蓮化痰軟堅散結為臣，鹿角霜補肝腎、調攝沖任，諸藥合用共奏行氣活血、化痰散結。經臨床驗證，該基本方具有疏肝行氣、活血祛疲、化痰散結之功效[1]。臨床及藥理試驗研究提示其參與性腺軸、激雌激素信號通路及免疫失衡調節[2] ，HE染色乳腺組織形態表明，與模型組比較其對過度增生有明顯的抑制作用，推測其可能參與增生細胞凋亡環節，促進其凋亡，抑制組織過度增生并修復乳腺組織結構。為闡明其療效機制，本文通過建立大鼠乳腺增生模型，來觀察慈蓮膠囊對凋亡途徑的影響。

細胞程序性死亡可分為外源性與內源性，外源性細胞凋亡，可由Fas和TNF受體等死亡受體介導，如Fas的配基（Fast）與Fas結合后，能夠激活凋亡因子caspase-8，次第激活caspase-3，終致細胞程序性死亡。內源性細胞凋亡，線粒體膜的通透性受外界刺激而改變，即而釋放出的細胞色素c招募其他凋亡因子形成凋亡體，從而激活caspase-9，次第激活caspase-3，終致細胞凋亡[3]。

fas廣泛分布于活化T.B細胞及單核細胞表面，廣泛表達于正常組織及腫瘤細胞上。fasl即fas配體是腫瘤壞死因子家族的細胞表面分子，僅表達于活化T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及免疫豁免部位及其他上皮。caspa家族是細胞啟動凋亡程序的關鍵，屬于半耽氨酸蛋白酶（caspa、家族）的caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。Fasl、fas和caspase3參與細胞程序性死亡。fas是靶細胞膜上的重要的死亡受體，免疫細胞上fasl與fas結合，活化并向靶細胞傳導死亡信號[3]，在靶膜內部caspase3接受到從fas傳到的死亡信號，開始執行外源性細胞凋亡程序。而乳腺組織周圍有著豐富的淋巴網和毛細血管網，T淋巴細胞可以通過淋巴網和毛細血管網到達乳腺組織附近觸發內外源性凋亡機制使增生的乳腺細胞發生凋亡反應，而起到保護和修復作用。

1 材料

藥品慈蓮膠囊（內蒙古自治區中醫醫院制劑中心提供，批號180307，內藥制字Z16010006）;獸用苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠生產，批號20180420）;黃體酮注射液（寧波第二激素廠生產，批號180225）;夏枯草膠囊（規格32 克/瓶，有效期36 個月，聚協昌北京藥業有限公司，20180101 生產，國藥準字210207747）;他莫昔芬片（四川迪菲特藥業有限公司，批號1706020）。動物SPF級雌性wistar未孕大鼠，9 周齡，購于內蒙古大學生命科學院，合格證號SCXK（內）2018-0090。

2 研究方法

2.1 造模

雌性大鼠肌內注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，1 次/d，連續25 d，其后用黃體酮肌注4 mg·kg-1，1 次/d，連續5 d。造模后光鏡下觀察大鼠乳腺組織結構及形態，根據乳腺增生大鼠模型病理診斷標準 ，造模成功依據為乳腺小葉增生和導管擴張。

2.2 分組及給藥

造模成功后，將大鼠隨機分為7 組，即西藥對照三苯氧胺組、中藥對照夏枯草組、慈蓮膠囊高，中、低劑量組，正常組、模型組。慈蓮膠囊的臨床應用劑量按成人60 kg 人每日4 g，相當于生藥0.95 g，大鼠每日給藥量分別為低（A組）0.063，中（B組）0.316，高（C組）0.632 g·kg-1·d-1;夏枯草組（E組）0.023 g·kg-1·d-1;三苯氧胺組（D組）0.018 g·kg-1·d-1。正常組（G組）、模型組（F組）（以等量水灌胃）：各組每日灌胃1 次，連續28 d。大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h， 腹腔內注射20% 烏拉坦麻醉大鼠。

2.3 乳腺標本取材與觀察指標

楔形取下大鼠第2對雙側乳房，用免疫組化技術檢測各組大鼠乳腺組織中 凋亡蛋白（Fas）和凋亡蛋白配體（Fasl）、抗凋亡基因（survivin）與促凋亡基因（caspase-8）的表達。

2.4 免疫組化法

取材、固定，將固定后的組織用水沖洗，去除殘留的液及雜質。不同濃度的乙醇每級2 h，50%、70%、85%、95%、無水乙醇逐級脫水。純乙醇和二甲苯的等體積混合液中置入組織塊2 h，浸入純二甲苯2 h×2次;置恒溫箱中，先將組織塊浸入熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液，浸漬1～2 h，再先后2 次浸漬于熔化的石蠟液約3 h×2次。包埋后切片，約為4～7 μm?？酒⒚撓灐⑺糜?.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液中，高壓修復15 min，室溫冷卻后，以0.02 M PBS 洗3 min×3 次。消除內源性過氧化物酶的活性，將玻片置于3% H2O2中，于濕盒孵育10 min，以0.02 M PBS 沖洗3 min×3次。一抗孵育：滴加一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 M PBS沖洗3 min×3次。加入HRP，標記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min～30 min。以0.02 M PBS沖洗3 min×3次。DAB染色后，以蘇木素復染3 min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察控制染色程度。水沖洗10 min，放入65℃烘箱中烘干。將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，置65℃烘箱中15 min烘干。在顯微鏡下觀察樣本并采集，計算陽性面積。

3 結果

凋亡因子在乳房組織的表達（見表1，圖1～圖6）。Fas陽性分布值A組明顯高于F、G、E組，與D組相似;FasL陽性分布值A組明顯低于F、E，與G、D組相似;caspase-8陽性分布值A組明顯高于F組、E組、G組、D組;survivin陽性分布值A組明顯低于F組、E組，G組于、D組相似。

4 討論

本研究提示慈蓮膠囊治療乳腺增生癥與激活免疫細胞與增生乳腺細胞之間的fas、fasL和caspase-8介導信號通路有關，在此干預的過程中上調fas、caspase-8的表達，并下調了Fasl蛋白的表達，使其表達量接近或低于正常的乳腺組織，具有活性的caspase-8可引發caspase級聯反應介導細胞凋亡、可激活線粒體途徑凋亡通路和參與內質網途徑。survivin獨特性表現為在有絲分裂時呈細胞周期依賴性表達，通過抑制caspase-3 和caspase-7來抑制多種凋亡觸發因子誘導的細胞凋亡，以確保細胞周期G2/M期正常分裂促進細胞周期進展[5]。在XIAP BIR域存在的情況下，survivin與所有胱天蛋白酶caspase-3，caspase-7和caspase-9強烈相互作用[6]。慈蓮方下調了Survivin的表達，進而促進了細胞凋亡發生。提示慈蓮膠囊通過參與多個凋亡通路環節抑制了乳腺增生的發展，促進了過度增生細胞凋亡的過程，發揮抗增生和修復作用。