超高效液相色譜-質譜聯用法測定發酵肉和發酵蔬菜中5種生物胺

虞太六

摘 要：建立了發酵肉和發酵蔬菜中5種生物胺的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品經5%高氯酸水溶液提取，用正己烷對樣品進行凈化。以液相色譜質譜聯用儀檢測萃取液中BAs的含量，采用HILIC柱分離，正ESI電離和MRM定性分析，采用外標法進行定量分析。5種BAs在1.0～1 000.0 ng/mL線性良好，相關系數R>0.995，檢出限為0.001 60～0.002 26 mg/kg，定量限為0.008 21～0.182 00 mg/kg。尸胺、腐胺和酪胺在添加水平分別為2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，組胺和色胺在添加水平分別為0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相對標準偏差為0.80%～8.69%。該方法快速、簡單、準確，適用于發酵肉和發酵蔬菜樣品中5種BAs的檢測。

關鍵詞：高效液相色譜-質譜聯用;生物胺;發酵肉;發酵蔬菜

Determination of Five Biogenic Amines in Fermented Meat and Fermented Vegetables by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YU Tailiu

（Shanghai Huabiao Testing Technology Service Co.， Ltd.， Shanghai 201112， China）

Abstract： A method was developed for the determination of 5 biogenic amines in fermented meat and fermented vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with 5% perchloric acid， and then cleaned-up by hexane. The 5 BAs were analyzed by liquid chromatography mass spectrometer with a HILIC chromatographic column， adopting the MRM mode with positive ESI. For accurate quantitative analysis， the external standard method was used. The calibration curves were linear with the correlation coefficients over 0.995 in the range of 1.0～1 000.0 ng/mL for the 5 BAs. The limits of detection were 0.001 60～0.002 26 mg/kg， The limits of quantification were 0.008 21～0.182 00 mg/kg. The mean recoveries of the cadaverine tyramine and putrescine at spiked levels of 2 mg/kg， 10 mg/kg， 50 mg/kg and of the histamine and tryptamine at spiked levels of 0.2 mg/kg， 1.0 mg/kg， 5.0 mg/kg were in the range from 79.0% to 98.0% with the relative standard deviations of 0.80%～8.69%. The developed method is rapid， simple， accurate. It is suitable for the determination of the 5 BAs in large quantities of fermented meat and fermented vegetable samples.

Keywords：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; biogenic amines; fermented meat; fermented vegetables

生物胺（Biogenic Amines，BAs）廣泛存在于各種食品中，且水產品、酒類產品、肉制品和乳制品等一般發酵食品中生物胺含量明顯高于非發酵食品[1]。適量生物胺可促進人體的正常生理活動，而過量攝入會產生不良反應。目前，檢測食品中生物胺的方法主要有液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]、薄層色譜法[4]和毛細管電泳法[5]。本文用5%高氯酸冰浴超聲提取，離心，取上清液，調節pH并定容，經正己烷凈化，建立食品中5種生物胺的高效液相色譜-質譜聯用（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯質譜Waters Xevo TQ-S，美國Waters公司;超聲波提取器、恒溫水浴振蕩器、渦旋振蕩器，上海安譜實驗科技股份有限公司。分析天平，美國Mettler Toledo公司;離心機，湖南湘儀離心機有限公司;離心管，上海安譜實驗科技股份有限公司;超純水儀，美國Millipore公司。87802F42-BF74-432F-92D9-02027006B9AA

乙腈（HPLC級）、高氯酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、甲酸和甲酸銨（HPLC級）。尸胺、腐胺、酪胺、組胺和色胺標準品，純度>98%。

1.2 標準溶液配制

（1）標準儲備液的配制（1.0 mg/L）。分別準確稱取適量尸胺、腐胺、酪胺、組胺和色胺分別用水溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1.0 mg/L的標準品儲備液，4 ℃保存，有效期1個月。

（2）混合標準品中間液（尸胺、腐胺和酪胺：200 μg/mL;組胺和色胺：20 μg/mL）。準確移取尸胺、腐胺和酪胺2 mL，組胺和色胺0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，4 ℃保存，有效期1個月。

（3）混合標準工作液（尸胺、腐胺和酪胺：2 μg/mL;組胺和色胺：0.2 μg/mL）。取0.1 mL混合標準品中間液置于10 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，混勻，4 ℃保存，有效期2周。

（4）準確移取生物胺混合標準工作液（尸胺、腐胺、酪胺濃度為2 μg/mL，組胺和色胺濃度為0.2 μg/mL）0.050 mL、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.000 mL、2.500 mL和5.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，用0.5%高氯酸溶液-乙腈溶液（準確量取25 mL 0.5%高氯酸溶液用乙腈定容至100 mL，混勻）稀釋并定容，其中尸胺、腐胺和酪胺濃度為10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL和1 000 ng/mL;組胺和色胺濃度為1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL和100.0 ng/mL，現配現用。

1.3 樣品前處理

稱取2 g試樣（精確至0.01 g）試樣于50 mL刻度離心管中，加入20 mL 5%高氯酸溶液，旋渦5 min，冰浴超聲20 min，5 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至另一50 mL刻度試管中;樣品殘渣再加入20 mL 5%高氯酸溶液重復提取一次，合并上清液。往上述上清液中加入適量400 g/L氫氧化鈉溶液調節pH至2～3，用0.5%高氯酸溶液定容至50 mL。取2 mL上述溶液至離心管中，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加入5 mL正己烷，振蕩混勻，離心，棄去正己烷層;再加入5 mL正己烷凈化，棄去正己烷層。吸取0.25 mL上述溶液至玻璃管中，加入0.75 mL乙腈，混勻，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.4 分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters XBridge HILIC色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：A為含10 mmol/L甲酸銨、0.5%甲酸的水溶液，B為含10 mmol/L甲酸銨、0.5%甲酸的乙腈溶液;流速：0.3 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：2 μL。流動相梯度洗脫程序見表1。

（2）質譜條件。電離源：ESI+;毛細管電壓：4.0 kV;

離子源溫度：150 ℃;脫溶劑溫度：400 ℃;脫溶劑氣流量：800 L/h;檢測方式：MS/MS，參數見表2。

2 結果與分析

2.1 分析條件優化

2.1.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用內標法定量，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定目標分析物的檢出限和定量限。測得發酵肉和發酵蔬菜中5種BAs的檢出限為0.001 60～0.002 26 mg/kg，定量限為0.008 21～0.182 00 mg/kg。5種BAs的標準曲線的相關系數均大于0.995。

2.1.2 方法的回收率和精密度

采用空白樣品中添加標準溶液的方法，進行添加回收實驗，尸胺、腐胺和酪胺添加水平分別為2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，組胺和色胺添加水平分別為0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照優化后的方法進行測定，每個質量濃度點平行測定6次，外標法校正。由表3實驗數據可知，在添加范圍內BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相對標準偏差為0.80%～8.69%。

2.1.3 實際樣品測定

使用建立的方法對10種發酵肉和10種發酵蔬菜中5種BAs殘留進行分析。20個樣品的測試結果表明如下。10種發酵肉中尸胺樣品濃度為ND～152 mg/kg，腐胺樣品濃度為ND～96.2 mg/kg，酪胺樣品濃度為ND～344 mg/kg，組胺樣品濃度為ND～484 mg/kg，色胺樣品濃度為ND～39.8 mg/kg。10種發酵蔬菜中尸胺樣品濃度為ND～132 mg/kg，腐胺樣品濃度為ND～122 mg/kg，酪胺樣品濃度為ND～194 mg/kg，組胺樣品濃度為ND～55 mg/kg，色胺樣品濃度為ND～2.55 mg/kg。

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-質譜串聯技術測定發酵肉和發酵蔬菜樣品中5種BAs殘留的分析方法。該方法的線性關系、準確度和精密度均能滿足殘留分析要求，其前處理方法簡單、凈化效果良好，適用于大量發酵食品樣品中5種BAs含量的快速檢測。

參考文獻

[1]ORD??EZ J L，TRONCOSO A M，GARC?A-PARRILLA M D C，et al.Recent trends in the determination of biogenic amines in fermented beverages： a review[J].Analytica Chimica Acta，2016，939：10-25.

[2]ONAL A.A review： current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods[J].Food Chem，2007，103（4）：1475-1486.

[3]FERNANDES J O，FERREIRA M A.Combined ion-pair extraction and gas chromatography-mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines， polyamines and aromatic amines in Port?wine and grape juice[J].J Chromatogr A，2000，886（1/2）：183-195.

[4]張微，李秀缺，陸容，等.淺談食品中生物胺的檢測方法[J].食品工程，2007（4）：55-57.

[5]CHIU T C，LIN Y W，HUANG Y F，et a1.Analysis of biologically active amines by CE[J].Electrophoresis，2006，27（23）：4792-4807.87802F42-BF74-432F-92D9-02027006B9AA