基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥治療失眠障礙伴抑郁、焦慮的分子機(jī)制

王瑞敏，劉 毅，李 菲，賈躍進(jìn)，劉 寧

失眠障礙是以一系列晝夜癥狀為特征的疾病，主要包括以入睡困難、易醒、早醒為主的睡眠滿意度差和以疲勞、情緒障礙、認(rèn)知功能降低為主的日間功能障礙[1]。10%～30%的人口可能受到影響[2]，且隨著社會環(huán)境改變，壓力增大，失眠障礙合并抑郁、焦慮日益成為普遍現(xiàn)象[3]，給生活帶來許多負(fù)面影響。西醫(yī)治療相關(guān)癥狀多選用苯二氮卓類受體激動劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等藥物，約40%的病人癥狀無法持續(xù)緩解[4-5]，并且可能帶來多種不良反應(yīng)[6-7]。因此，探討安全有效的治療失眠障礙合并抑郁、焦慮的方法成為重要的研究課題。中藥治療通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用，臨床應(yīng)用安全有效，具有一定的優(yōu)勢[8-9]。本研究通過對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘以探討中藥治療失眠障礙的用藥規(guī)律及核心藥物的潛在作用機(jī)制，以期為臨床用藥和進(jìn)一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)挖掘

1.1.1 數(shù)據(jù)收集與整理 通過檢索2016年1月1日—2020年5月12日中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫中失眠障礙伴抑郁、焦慮的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索表達(dá)式以中國知網(wǎng)為例：(SU=失眠障礙OR SU=不寐 OR SU=失眠癥)AND(SU=抑郁 OR SU=焦慮OR SU=郁證)，初步得到中國知網(wǎng)文獻(xiàn)290篇，萬方文獻(xiàn)416篇，維普文獻(xiàn)91篇。

1.1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 診斷、安全性、有效性明確的使用中藥治療的醫(yī)者驗案；中藥治療結(jié)果有效的臨床試驗、臨床觀察、回顧性研究等。

1.1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)據(jù)庫間文獻(xiàn)重復(fù)者(取其一)；單純理論研究、綜述和動物實驗；診斷、療效、安全性不明確；處方不完整；不同文獻(xiàn)處方相同(取其一)；以基礎(chǔ)方辨證或依癥加減(取基礎(chǔ)方)；干預(yù)方式不包括中藥。

1.1.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、錄入與挖掘 根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共得到文獻(xiàn)163篇，方劑189首，以雙人雙錄入法將其錄入至古今醫(yī)案云平臺V2.2.3提供的模板中，使用軟件提供的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化程序并結(jié)合2015版《中華人民共和國藥典》[10]與第7版《中藥學(xué)》[11]對中藥名稱進(jìn)行規(guī)范，如：“炒棗仁”統(tǒng)一為“酸棗仁”。之后使用數(shù)據(jù)挖掘模塊分別對中藥進(jìn)行藥物頻次、性味歸經(jīng)統(tǒng)計及關(guān)聯(lián)分析、聚類分析和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，并綜合獲得核心藥物組成。

1.2 核心藥物組成及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 核心藥物有效成分及對應(yīng)靶點篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索核心組方各藥物，按照口服生物利用度(OB)≥30%、血腦屏障(BBB)≥-0.3、類藥性(DL)≥0.18篩選，分別獲得有效成分和相應(yīng)靶點，若TCMSP中無某成分靶點則利用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點。

1.2.2 疾病靶點獲取與藥物-疾病交集建立 通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)等數(shù)據(jù)庫，檢索得到失眠障礙的相關(guān)靶點，取1.2.1有效成分靶點與失眠障礙靶點的交集。

1.2.3 疾病-組方-藥物-成分-靶點及蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別以有效成分、靶點及疾病、組方為節(jié)點，相互作用為邊，通過Cytoscape V3.6.0構(gòu)建疾病-組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。將得到的交集靶點導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)，設(shè)置物種為智人，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用MCODE插件進(jìn)行分析，并獲取其核心靶點。

1.2.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將1.2.2得到的交集靶點導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/)或ClueGO插件，分別進(jìn)行GO生物過程、分子功能、細(xì)胞組成和KEGG通路富集分析，之后使用在線作圖工具易漢博(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制GO富集氣泡圖，并下載關(guān)鍵通路作用圖。

1.3 關(guān)鍵有效成分與關(guān)鍵靶點分子對接分析 選擇疾病-組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點居前7位的有效成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中綜合各聚類節(jié)點居前5位的關(guān)鍵靶點，通過PDB(http://www.rcsb.org/)和ZINC(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫分別得到關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu)，處理后使用Vina進(jìn)行分子對接，并使用Pymol進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 藥物頻次及屬性統(tǒng)計 共篩選出相關(guān)文獻(xiàn)163篇，方劑189首，涉及中藥212味，總應(yīng)用頻次2 273次，其中藥物應(yīng)用百分比≥20%有18味，應(yīng)用總頻次為1 068次，約占總頻次半數(shù)，其中頻次居前5位分別為甘草、柴胡、酸棗仁、茯苓、白芍，詳見表1。將212味藥物進(jìn)行屬性分析，結(jié)果以雷達(dá)圖表示，詳見圖1。其中藥性分布主要為平、溫、微寒、寒；藥味主要甘、苦、辛；歸經(jīng)主要歸心經(jīng)、肝經(jīng)。

圖1 四氣、五味、歸經(jīng)頻次分布雷達(dá)圖

表1 藥物使用情況(百分比≥20%，n=189)

2.1.2 藥物關(guān)聯(lián)分析、聚類分析、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析及核心成分確定 將189首處方利用云平臺數(shù)據(jù)分析，首先將設(shè)置置信度≥0.58，支持度≥0.17，得到17組藥物關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，詳見表2。將藥物應(yīng)用百分比≥20%的18味中藥進(jìn)行聚類分析，同時設(shè)置距離類型為歐氏距離，聚類方法為最長距離法，將18味中藥分為5個聚類處方。C1：黃連、黃芩、半夏；C2：遠(yuǎn)志、首烏藤、茯神、合歡皮、龍骨、牡蠣；C3：柴胡、白芍、甘草；C4：酸棗仁、茯苓；C5：川芎、梔子、當(dāng)歸、白術(shù)等，詳見圖2。最后設(shè)置節(jié)點≥138，進(jìn)行中藥-中藥復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，得到由5味中藥組成的核心組合，詳見圖3。綜合以上并結(jié)合藥物頻次得到最核心藥物組方：柴胡、白芍、酸棗仁、茯苓、甘草。

表2 藥物關(guān)聯(lián)分析

圖2 藥物聚類分析

圖3 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 核心組方有效成分和對應(yīng)靶點 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，規(guī)定ADME值，并結(jié)合SwissTarget Prediction預(yù)測靶點，篩選出柴胡有效成分9種，相關(guān)靶點89個；白芍有效成分3種，相關(guān)靶點27個；酸棗仁有效成分7種，相關(guān)靶點35個；茯苓有效成分6種，相關(guān)靶點112個；甘草有效成分69種，相關(guān)靶點58個；重復(fù)成分2種，分別為白芍、酸棗仁、甘草共有的丁子香萜(mairin)和白芍、甘草共有的谷甾醇(sitosterol)。經(jīng)過去重排除后，共獲得有效成分91種，相關(guān)靶點217個。核心藥物組成部分成分相關(guān)信息詳見表3。

表3 核心藥物組成部分成分相關(guān)信息

2.2.2 疾病靶點和藥物-疾病靶點交集結(jié)果 在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中分別檢索得到2 281個、673個、28個靶基因，合并數(shù)據(jù)并去重，共得到失眠障礙靶點基因2 916個。將失眠障礙靶基因與獲得的有效成分相關(guān)靶點217個靶基因合并取交集，得到66個交集基因，詳見圖4。

圖4 藥物-疾病交集基因Venn圖

2.2.3 疾病-組方-中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建疾病-組方-中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。其中包含150個節(jié)點、620條邊，從以上網(wǎng)絡(luò)可得節(jié)點度較大的關(guān)鍵有效成分為：花生酸(FL4)、脫氫表皮酸(FL6)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(GC7)、驢食草酚(GC58)、芒柄花黃素(GC8)、β-谷固醇(BS1)和豆甾醇(CH2)。在STRING中導(dǎo)入66個交集靶點基因，進(jìn)行PPI分析，并使用MCODE插件將靶點分成3個聚類，詳見圖6。圖中共66個節(jié)點、313條線，平均節(jié)點為9.48，根據(jù)節(jié)點篩選每個聚類的核心靶點，C1：MAOA、ACHE、HTR1A、HTR3A、CHRNA4；C2：TNF、VEGFA、SLC6A4、ESR1；C3：PARP1、SLC6A2。

圖5 疾病-核心組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 利用Metascape對66個交集靶點進(jìn)行富集分析，其中GO功能富集分析共獲得907條結(jié)果，包括GO生物過程745條，GO分子功能104條，GO細(xì)胞組成58條。設(shè)定P<0.01，最小計數(shù)為3，富集因子>1.5，選擇排名居前20位、前15位、前10位的富集項，繪制氣泡圖，詳見圖7。其中生物過程主要包括血液循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、化學(xué)突觸傳遞、有機(jī)羥基化合物代謝、細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)等；分子功能主要包括G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、類固醇激素受體活性等；細(xì)胞組成主要包括突觸膜的組成部分、膜筏、GABA能突觸等。KEGG通路富集分析獲得69條信息通路，將結(jié)果導(dǎo)入ClueGO，繪成關(guān)鍵通路圖詳見圖8。以通路、交集靶點、有效成分為節(jié)點，構(gòu)建成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)，詳見圖9。主要通路涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、癌癥中的蛋白聚糖、催乳素信號通路等。其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路處于關(guān)鍵地位，提示核心組方可能通過此通路對失眠障礙發(fā)揮治療作用，詳見圖10。

圖7 GO富集分析氣泡圖

圖8 KEGG主要富集通路圖

圖9 成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖10 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路圖

2.3 分子對接結(jié)果 關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵成分分子對接結(jié)果均≤-20.90 kJ/mol，提示該7種關(guān)鍵成分均與5種關(guān)鍵靶點形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，詳見表4。取對接較好的3個組合進(jìn)行可視化，詳見圖11。

表4 分子對接結(jié)果 單位：kJ/mol

圖11 分子對接構(gòu)象圖(A為SLC6A4和CH2；B為MAOA和GC8；C為ACHE和FL4)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)稱失眠障礙為“不寐”，認(rèn)為總病機(jī)為“營衛(wèi)失和、陰陽不交[12]”，《臨證指南醫(yī)案》記載：“不寐之故，總是陽不交陰所致[13]”。對伴隨抑郁、焦慮的失眠障礙當(dāng)從肝論治[14]，所謂“凡郁皆肝病也[15]”。中醫(yī)臟腑理論認(rèn)為肝主要有主疏泄和藏血的生理功能，故肝郁氣滯或肝血不足是導(dǎo)致不寐的重要病機(jī)，《辨證錄·不寐門》記載：“氣郁既久，則肝氣不舒，肝氣不舒，則肝血必耗，肝血既耗，則木中之血上不能潤于心，而則不寐[16]”。因此，治療失眠障礙伴抑郁、焦慮，主要是從肝論治，證型主要包括兩方面，即肝郁氣滯和肝血不足。

數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示，治療藥物中使用頻率最高的為甘草、柴胡、酸棗仁、茯苓、白芍。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，這些高頻藥物具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗焦慮或神經(jīng)保護(hù)等作用，其中一些藥物兼具對肝臟的保護(hù)作用[17-21]。從藥性來看，應(yīng)用最多者為平、溫、微寒，可見失眠障礙伴抑郁、焦慮無明顯寒熱偏向，因肝郁氣滯和肝血不足皆表現(xiàn)出寒熱，所謂“氣有余便是火，氣不足便是寒”“血證有四：曰虛，曰瘀，曰熱，曰寒”。藥味主要為甘、苦、辛，與藥性結(jié)果一致，另外甘味藥可補(bǔ)肝血之不足，補(bǔ)肝脾同病之脾虛，同時可調(diào)和諸藥，辛味藥能散能行，對肝郁之證。藥物歸經(jīng)主要歸心經(jīng)、肝經(jīng)，本病屬神志疾病，與心主神明直接相關(guān)，而治當(dāng)從肝論治，故藥物多入心經(jīng)、肝經(jīng)。藥物關(guān)聯(lián)分析中選定同現(xiàn)頻次>50次(支持度>0.25)為核心組合，分別為：茯苓→甘草，柴胡→甘草，茯苓→酸棗仁，白芍→柴胡，其中甘草為常用佐使藥，柴胡-白芍組合為臨床常用藥對，可疏肝理氣、養(yǎng)血柔肝，是逍遙散、柴胡疏肝散、四逆散等常用方劑中的主要藥物，常用于治療肝郁氣滯的病證；酸棗仁-茯苓組合是張仲景治療“虛勞虛煩不得眠”的酸棗仁湯主要藥物，可用于肝血不足的不寐。聚類分析中：C3、C4聚類組合分別是柴胡、白芍、甘草和酸棗仁、茯苓。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析中的核心藥組為上述5味藥物，且此5味藥物是使用頻次最高的藥物，并囊括了失眠障礙伴抑郁、焦慮的兩大基本證型，因此確定該5味藥物為治療失眠障礙伴抑郁、焦慮的核心藥物組成。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到核心藥物組合發(fā)揮作用的7個主要有效成分，其中FL4、FL6屬于茯苓中的三萜類化合物，有研究顯示其具有一定鎮(zhèn)靜作用[22]；GC7、GC8、GC58是甘草中的黃酮類物質(zhì)，有研究顯示該類物質(zhì)可增強(qiáng)記憶和保護(hù)神經(jīng)[23]，GC8在動物實驗中表現(xiàn)為抗焦慮作用[24]；BS1可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素介導(dǎo)表現(xiàn)出抗抑郁作用[25]；CH2是一種植物甾醇，可促進(jìn)神經(jīng)調(diào)節(jié)[26]。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)得到核心靶點，其中TNF被證實在生理和病理生理條件下對CNS(包括通過組織再生和神經(jīng)發(fā)生)的減少產(chǎn)生作用[27-28]；VEGFA被認(rèn)為可轉(zhuǎn)導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗抑郁和神經(jīng)營養(yǎng)作用[29]；SLC6A4可調(diào)節(jié)CNS中的5-HT，HTR1A、HTR3A是5-HT的受體，而5-HT在睡眠-覺醒周期及焦慮、抑郁中發(fā)揮著重要的作用[30-32]；MAOA、MAOB在調(diào)節(jié)突觸功能和單胺代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其抑制劑常作為抗抑郁或神經(jīng)退行性疾病的治療藥物[33]；ACHE可將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解，從而終止神經(jīng)傳遞，服用ACHE抑制劑證實可改善睡眠[34-35]，CHRNA4是乙酰膽堿受體亞基，包括睡眠、喚醒、焦慮在內(nèi)的多種大腦功能與其有關(guān)[36]。

由GO功能富集分析得到核心組方對失眠障礙伴抑郁、焦慮治療作用的主要生物過程為血液循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、化學(xué)突觸傳遞。其中神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)和化學(xué)突觸傳遞已證實是失眠障礙、抑郁、焦慮的主要生物過程。另有研究顯示，睡眠-覺醒與人腦血液循環(huán)相關(guān)，細(xì)菌種群與免疫系統(tǒng)內(nèi)復(fù)雜的相互作用通過血液循環(huán)影響CNS，而抑郁、焦慮與相互作用有關(guān)[37-38]，該生物過程與中醫(yī)證型的肝血途徑一致。KEGG通路富集分析主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸。目前已知的食欲素、多巴胺、去甲腎上腺素和組胺等促覺醒物質(zhì)與GABA、5-HT、褪黑素等促睡眠物質(zhì)均通過這些通路調(diào)控睡眠[39]；催乳素在腦中表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育，對睡眠和神經(jīng)有保護(hù)作用[40]。分子對接結(jié)果顯示，核心有效成分和核心靶點均可穩(wěn)定結(jié)合，其中與各有效成分對接較好的靶點為SLC6A4、MAOA和AchE，提示核心組方可能通過這3個靶點發(fā)揮作用，而CH2和BS1是與關(guān)鍵靶點對接較好的成分，說明這2個成分可能是本方發(fā)揮作用的主要成分。

綜上所述，通過數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究，初步得到中藥治療失眠障礙伴抑郁、焦慮的核心組方為柴胡、白芍、酸棗仁、茯苓、甘草，其多成分、多靶點、多通路作用機(jī)制涉及的核心成分為β-谷固醇和豆甾醇；核心靶點為SLC6A4、MAOA和ACHE；主要通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸。該結(jié)論可為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供參考。