心肌缺血病人脯氨酸羥化酶2的表達及其干預(yù)HL-1缺氧損害的機制

駱元平，吳鐘偉，曾垂旭

心血管疾病帶來沉重的醫(yī)療和社會負擔，美國約500萬例病人受到影響，其中缺血性心臟病是心力衰竭的主要原因，也是導(dǎo)致臨床心血管疾病發(fā)病率和死亡率較高的主要原因，是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題[1]。有研究顯示，缺血性心臟病引起的心肌損傷可能是由于心肌缺血或缺氧后血供恢復(fù)所致[2]，然而，潛在的機制尚未明確。因此，從缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型中尋找有效的治療靶點和潛在機制，可為臨床預(yù)防和治療心肌缺血疾病提供科學(xué)思路。

脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白(PHDs)是一種雙加氧酶，通過羥基化低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)中保守的Prolyl殘基，與細胞對氧可用性的反應(yīng)密切相關(guān)[3]。PHD家族由3個成員組成，PHD1、PHD2和PHD3，每個亞型均顯示出組織和細胞系的特異性功能[4]。在3種PHDs中，PHD2在PHD活性中作用最強，在結(jié)腸癌、肝癌和黑色素瘤中表達較低，對癌細胞存活和腫瘤細胞增殖具有抑制作用[5-7]。然而，關(guān)于評估PHD在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中作用的研究較少。因此，探討PHD2在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型中的作用及潛在機制，可為缺氧造成的心肌缺血性疾病提供新方向。本研究檢測心肌缺血病人血清PHD2表達，進一步探討PHD2在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中的作用和潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床樣本 收集我院健康體檢者和心內(nèi)科心肌缺血病人血清樣本各35份。所有研究對象均簽署知情同意書，所有血清樣本保存于-80 ℃條件下待用。

1.1.2 實驗細胞 小鼠心肌細胞HL-1購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 實驗試劑 PHD2酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒購自美國LSBio公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購自北京欣博生公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；谷氨酰胺購自美國Sigma-Aldrich公司；過表達PHD2的質(zhì)粒和載體pcDNA3.1由Invitrogen公司提供，Lipofectamine 3000試劑購自Life Technologies公司；四唑鹽(MTT)和結(jié)晶紫染色液購自美國Sigma公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和Transwell試劑盒購自美國Millipore公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR Premix Ex TaqTM和SYBR PrimeScript PLUS RT-RNA PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解緩沖液購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，PHD2、p65、p-p65、核因子抑制蛋白α(IκB-α)、磷酸化IκB-α(p-IκB-α)和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technologies公司；辣根過氧化酶(HRP)標記的抗小鼠和兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和缺氧模型的構(gòu)建 小鼠心肌細胞HL-1在含有10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、2 mmol/L的L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常氧條件下，細胞在37 ℃，95%O2和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為刺激缺氧，細胞被孵育在含有94%N2、5%CO2和1%O2的37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 選擇對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染。準備2個滅菌的1.5 mL EP管，A管加入500 μL的DMEM和4 μg質(zhì)粒，B管加入500 μL的DMEM和8 μL的Lipofectamine 3000，再緩慢將A管中液體滴入B管，邊滴邊震蕩混勻，室溫靜置20 min，將混合液加入對應(yīng)的細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后檢測相關(guān)蛋白表達。

1.2.3 細胞存活率 采用MTT法測定細胞存活率。將細胞以1×105個/孔的接種密度接種到96孔板中，于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)2 d。將MTT溶液(5 mg/mL)在缺氧后12 h、24 h、72 h和96 h分別加入每孔中，在37 ℃下孵育4 h。每孔加入100 μL二甲基亞砜后，使用不含細胞的孔作為空白，使用酶標儀在570 nm處讀取吸光度。細胞存活率(%)=(處理細胞/對照細胞)×100%。

1.2.4 細胞遷移和侵襲能力 24孔Transwell室用于細胞侵襲實驗。將1×105個細胞(200 μL)無血清培養(yǎng)基中的細胞接種于24孔Transwell培養(yǎng)室的上腔室中，將600 μL含10%FBS的細胞培養(yǎng)液加入下腔室中培養(yǎng)。細胞在37 ℃、5%CO2的濕化環(huán)境中培養(yǎng)24 h，使用棉簽小心地從過濾器的上表面去除未侵襲的細胞。之后用100%甲醇固定細胞30 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min。遷移細胞在相差顯微鏡下計數(shù)。同樣遷移的測定方法不覆蓋上腔室基質(zhì)，并在24 h內(nèi)計數(shù)遷移細胞。

1.2.5 流式細胞術(shù) 使用碘化丙啶(PI)和異硫辛酸熒光素(FITC)結(jié)合的Annexin V染色進行細胞凋亡分析。細胞在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗滌，懸浮在結(jié)合緩沖液中，并根據(jù)實驗說明書，在50 μg/mL RNase A存在下，用PI和FITC-Annexin V染色。流式細胞術(shù)分析采用FACScan，數(shù)據(jù)分析使用FlowJo軟件。

1.2.6 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR) 使用Trizol試劑按照說明書從細胞中提取總RNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM進行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR。采用一步法SYBR PrimeScript PLUS RT-RNA PCR試劑盒測定PHD2表達水平。PHD2正向引物序列為5′-TGAGCAGCATGGACGACCTGAT-3′，反向引物序列為5′-GACATAGCCTGTTCCGTTGCCT-3′；GAPDH正向引物序列為5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTGT-3′，反向引物序列為5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算相對表達水平。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 收集細胞采用添加蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取。使用8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離出相同數(shù)量的蛋白質(zhì)，并采用電印跡法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%的牛奶室溫封閉膜1 h，1×TBST洗滌3次后，用PHD2、p65、p-p65、IκB-α、p-IκB-α和GAPDH等特異性抗體4 ℃孵育過夜。次日用HRP標記的抗小鼠和兔二抗(1∶10 000)孵育1 h。1×TBST洗滌后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液進行顯影。使用Image J軟件分析蛋白灰度分析。

1.2.8 ELISA 使用ELISA試劑盒測定HL-1培養(yǎng)上清液促炎細胞因子水平。收集100 μL細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA說明書測定TNF-α、IL-6、IL-1β促炎因子。每一樣品做3個復(fù)孔，取均值。

2 結(jié) 果

2.1 健康體檢者和心肌缺血病人血清PHD2表達 RT-qPCR結(jié)果顯示，與健康體檢者比較，心肌缺血病人血清PHD2表達下調(diào)(P<0.001)。詳見圖1。

與健康體檢者比較，＊P<0.001。圖1 健康體檢者和心肌缺血病人血清PHD2表達

2.2 缺氧對HL-1損傷和PHD2的影響 與常氧比較，缺氧后24 h、72 h和96 h細胞存活率均降低(P<0.05)，缺氧處理后細胞遷移和侵襲能力降低(P<0.05)，細胞凋亡增加(P<0.01)。RT-qPCR和Western Blot分析結(jié)果顯示，與常氧比較，缺氧處理后HL-1中PHD2表達下調(diào)(P<0.05)。詳見圖2。提示缺氧可抑制細胞活力、遷移，促進HL-1凋亡，同時下調(diào)PHD2表達。

與常氧比較，＊P<0.05，#P<0.01，△P<0.001。圖2 缺氧對HL-1損傷和PHD2表達的影響[A為MTT分析缺氧對HL-1存活率的影響；B為Transwell分析缺氧對HL-1遷移和侵襲的影響(×40)；C為缺氧對HL-1遷移影響的柱狀圖；D為缺氧對HL-1侵襲影響的柱狀圖；E為缺氧對HL-1凋亡影響的柱狀圖；F為缺氧對HL-1中PHD2 mRNA表達影響的柱狀圖；G為Western Blot分析缺氧對HL-1中PHD2蛋白表達影響的電泳圖]

2.3 PHD2過表達質(zhì)粒驗證 為進一步探討PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷的影響，首先構(gòu)建了pcDNA3.1-PHD2過表達質(zhì)粒。將pcDNA3.1陰性對照質(zhì)粒和pcDNA3.1-PHD2過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HL-1，采用RT-qPCR和Western Blot檢測PHD2表達，驗證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。結(jié)果顯示，相較于常氧+pcDNA3.1組，常氧+pcDNA3.1-PHD2組PHD2 mRNA表達升高(P<0.01)。詳見圖3。說明pcDNA3.1-PHD2過表達質(zhì)粒構(gòu)建且轉(zhuǎn)染成功。

與常氧+pcDNA3.1組比較，＊P<0.01。 圖3 過表達PHD2質(zhì)粒驗證(A為RT-qPCR檢測過表達PHD2后HL-1中PHD2 mRNA水平；B為Western Blot檢測過表達PHD2后HL-1中PHD2蛋白水平)

2.4 過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷的影響 進一步檢測過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷的影響。結(jié)果顯示，與缺氧+pcDNA3.1組比較，缺氧+pcDNA3.1-PHD2組缺氧24 h、72 h和96 h后可增加細胞存活率(P<0.05)，同時促進了HL-1的遷移和侵襲能力(P<0.05)，細胞凋亡被抑制(P<0.01)。詳見圖4。提示過表達PHD2可抑制缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷，包括提高細胞存活率，促進細胞遷移和侵襲，同時抑制細胞凋亡。

與缺氧+pcDNA3.1組比較，＊P<0.05，#P<0.01，△P<0.001。圖4 過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷的影響[A為MTT分析過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1存活率的影響；B為Transwell分析過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1遷移和侵襲的影響(×40)；C為過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1遷移影響的柱狀圖；D為過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1侵襲影響的柱狀圖；E為過表達PHD2對缺氧誘導(dǎo)的HL-1凋亡影響的柱狀圖]

2.5 過表達PHD2對HL-1中NF-κB信號通路的影響 采用Western Blot分析過表達PHD2對缺氧條件下HL-1中NF-κB信號通路的影響，結(jié)果顯示，相較于缺氧+pcDNA3.1組，缺氧+pcDNA3.1-PHD2組p65、p-p65、IκB-α和p-IκB-α蛋白水平降低。采用ELISA檢測各組促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達，結(jié)果顯示，相較于缺氧+pcDNA3.1組，缺氧+pcDNA3.1-PHD2組促炎因子TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-6和IL-1β水平無明顯變化。詳見圖5。提示過表達PHD2對缺氧條件下HL-1損傷的保護作用可能通過抑制NF-κB信號通路引起的。

與缺氧+pcDNA3.1組比較，＊P<0.01。 圖5 過表達PHD2對NF-κB信號通路的影響(A為Western Blot檢測過表達PHD2對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達條帶圖；B為ELISA分析過表達PHD2對促炎因子TNF-α水平影響的柱狀圖；C為ELISA分析過表達PHD2對促炎因子IL-6水平影響的柱狀圖；D為ELISA分析過表達PHD2對促炎因子IL-1β水平影響的柱狀圖)

3 討 論

隨著人們生活方式的改變，心血管疾病開始在我國流行。目前，心血管疾病是我國民眾嚴重的健康問題之一，發(fā)病率和死亡率較高[8]。其中急性心肌梗死、心力衰竭和缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因[9]。有研究顯示，這些疾病主要與心肌缺血相關(guān)，而心肌缺血主要是由缺氧引起的，表現(xiàn)為流向心臟的血液量減少，心肌無法獲得充足的氧氣，使心肌細胞受損[10]。本研究通過構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型，進一步探討治療心肌缺血的潛在靶點和分子機制。

PHDs是負責(zé)催化氧化低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的特定保守脯氨酸殘基的酶，但關(guān)于PHD蛋白的其他作用尚未明確。已鑒定的PHD酶中，PHD2認為是關(guān)鍵的分子氧傳感器，PHD2通過羥基化作用調(diào)節(jié)常氧條件下的HIF-1蛋白水平，促進蛋白酶體降解，負責(zé)多種反應(yīng)，如血管生成、紅細胞生成、細胞代謝、生存能力和增殖[11-13]。相關(guān)研究顯示，PHD2對缺氧條件下腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、腫瘤相關(guān)的成纖維細胞活力及巨噬細胞的代謝和功能有一定的抑制作用[12，14-15]。在心肌缺血和缺氧條件下對心肌細胞的影響報道較少。因此，本研究觀察PHD2對心肌缺血和缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的影響，結(jié)果顯示，相較于健康體檢者，心肌缺血病人血清PHD2表達水平較低。同時，在缺氧誘導(dǎo)的HL-1中，HL-1存活率、遷移和侵襲降低，同時細胞凋亡增加，PHD2 mRNA表達為較低水平。在缺氧誘導(dǎo)的HL-1中過表達PHD2時，顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷。因此，PHD2對缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損害具有保護作用。

NF-κB是代表一個家族的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)不同的免疫和炎癥反應(yīng)，是與細胞周期調(diào)控和炎癥相關(guān)的關(guān)鍵因子，可促進細胞凋亡和抑制細胞存活率[16]。有研究顯示，PHD2通過抑制NF-κB活動進而發(fā)揮抗癌和抗炎作用，如直腸癌、骨關(guān)節(jié)炎和自身免疫疾病等[17-18]。本研究中，過表達PHD2抑制了缺氧誘導(dǎo)的HL-1中NF-κB激活，可能通過抑制IκB-α磷酸化實現(xiàn)的。采用ELISA檢測了NF-κB的下游基因TNF-α、IL-6和IL-1β，結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的HL-1中TNF-α水平被過表達的PHD2抑制，而IL-6和IL-1β無明顯變化。表明這些促炎因子可能受其他微環(huán)境的影響。因此，PHD2通過抑制NF-κB進而對缺氧誘導(dǎo)的HL-1損傷具有保護作用。

綜上所述，PHD2在心肌缺血病人血清和缺氧誘導(dǎo)的HL-1中低表達，過表達PHD2可抑制缺氧誘導(dǎo)HL-1存活率、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，進而抑制缺氧對HL-1損傷，其分子機制可能是通過抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)的。本研究為臨床診斷和治療心肌缺血造成的心血管疾病提供了一個新靶點。