心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達與心房纖維化程度及復發的關系

周曉蘭，楊 帆，徐大春，黃建飛，盧 毅，劉建云

心房顫動是一種常見的心律失常，且發病率逐年升高，病人致死率和致殘率增加。有研究顯示，心房顫動的發生和維持與心房病理生理改變密切相關，主要表現為心房重構，心房纖維化是結構重構的主要特征[1]。心房纖維化是指細胞外基質中膠原含量增加或(和)膠原成分發生改變，特征為心臟成纖維細胞合成增加，細胞外基質蛋白過度沉積，導致心肌細胞外基質纖維化[2]。近年來，導管射頻消融術已成為治療心房顫動的重要方法，但病人術后復發率較高，需要再次消融比例為20%～30%[3]。miRNA是一類在生物進化上高度保守的內生性小分子單鏈RNA，近年來多種miRNA被發現在心房顫動病人心房纖維化過程中異常表達，且與心房纖維化程度有關。miR-320d是miR-320家族中的一員，近年來對miR-320家族的研究逐漸增多，膠質瘤組織和細胞系中miR-320d表達顯著降低，過表達miR-320d可抑制癌細胞生長、遷移和侵襲[4]。

B細胞淋巴瘤病人低表達miR-320d提示有較短的生存期[5]。miR-320d與癌癥關系的研究較多，但對心肌細胞的影響較少，外泌體是細胞外囊泡中的一種亞群，可在心肌細胞間充當信號轉導分子，近年來外泌體在心血管系統中的作用越來越受到重視。本研究檢測心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達水平，分析miR-320d與心房顫動病人心房纖維化程度及復發的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2020年7月南通市第六人民醫院收治的心房顫動病人108例作為研究組，其中男57例，女51例，年齡(56.13±10.02)歲；選取同期入院體檢的健康體檢者100名作為對照組，其中男52名，女48名，年齡(55.43±8.94)歲。病人納入標準：入院時行標準12導聯心電圖診斷為心房顫動；既往無心房顫動消融術病史；臨床資料完整；所有病人均知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：合并急性或終末期肝病、嚴重慢性阻塞性肺疾病、急性冠脈綜合征；合并惡性腫瘤；合并甲狀腺功能異常等自身免疫性疾病；安裝起搏器病人，嚴重心動過速或心動過緩。

1.2 研究試劑與儀器 Serum/plasma micro kit試劑(博奧派克，貨號：555000)、逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司生產，貨號：TR102-01/02)、Ⅰ型膠原羧基端前肽(PⅠCP)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司生產，貨號：EH0957)、Ⅲ型前膠原多肽(PⅢNP)ELISA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司生產，貨號：xl-Eh0453)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)ELISA試劑盒(南京賽鴻瑞生物科技有限公司生產，貨號：SEA097Ov02)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集與保存 采集所有研究對象空腹靜脈血4 mL，使用含EDTA-K2的真空采血管抗凝，以3 000 g離心5 min，分離血漿，將分離后的血漿轉移至無菌無酶的EP管中，置于-80 ℃保存。使用外泌體提取試劑盒提取血漿標本中的外泌體，用于RNA提取。

1.3.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測血清miR-320d水平 通過miRNeasy serum/plasma micro kit(博奧派克，美國)試劑提取血漿外泌體RNA，所有步驟均在冰上操作，預防RNA降解。采用試劑盒檢測血漿外泌體中miR-320d表達水平，取1 μg RNA按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應合成cDNA，加入SYBR Green PCR Master Mix進行PCR擴增，反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s變性；60 ℃ 1 min退火延伸，45個循環進行擴增，每個樣品重復3次，以U6作為內參，以2-△△ct計算miR-320d的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.3.3 超聲心動圖 采用多普勒超聲診斷儀對研究對象行心臟超聲心動圖檢查，包括左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左房內徑(left atrial diameter，LAD)及左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.3.4 心房纖維化血清標記物 采用ELISA檢測所有研究對象心房纖維化血清生化標記物PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平，具體操作按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自美國R&D Systems公司。

1.3.5 心房纖維化程度 按照心房顫動相關指南[6]中的環肺靜脈電隔離導管射頻消融術原則及方法，在CARTO-3三位標測系統下構建左房和各肺靜脈口三維電解剖圖，記錄左房前壁、后壁、頂部和間隔部電壓，重建左房電壓圖。記錄接觸壓力標測圖(采點壓力5～10 g)，術中連續記錄肺靜脈等腔內點位，消融導管阻抗、溫度、功率等，在CARTO-3標測系統指導下實時顯示消融導管的接觸壓力(CF)，導管消融閾值為最大移動穩定范圍2 mm，最小時間3 s，最小壓力6 g，常規設置FT1>300 g·s進行標測。消融順序：按照左側肺靜脈環形消融、右側肺靜脈環形消融、左房頂部線及二尖瓣峽部線消融、驗證房頂線阻滯；定義正常心內膜電壓振幅>1.5 mV，心內膜低電壓<0.5 mV區域為CARTO圖像纖維化區域，根據CARTO左心房點解剖圖像，中線及二尖瓣將前后壁分為8個象限，≤2個象限出現低血壓為輕度心房纖維化，≥3個象限出現低電壓為重度心房纖維化。

1.3.6 隨訪 采取門診復查方式對病人進行隨訪，隨訪時間為12個月，復查心臟彩色超聲心動圖及24 h動態心電圖，根據復查結果將心房顫動病人分為復發組(44例)和未復發組(64例)。

2 結 果

2.1 研究組和對照組血漿外泌體miR-320d表達與心功能指標比較 與對照組比較，研究組血漿外泌體miR-320d表達水平和LVEF降低，LAD增加，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見表2。

表2 研究組和對照組血漿外泌體miR-320d表達與心功能指標比較(±s)

2.2 血漿外泌體miR-320d表達水平與心房纖維化的關系 根據心房顫動病人血漿外泌體miR-320d表達水平分為miR-320d高表達組(56例)和miR-320d低表達組(52例)。與miR-320d高表達組比較，miR-320d低表達組心房纖維化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見表3。

表3 不同血漿外泌體miR-320d表達水平病人心房纖維化指標比較

2.3 不同復發情況病人臨床資料比較 復發組高血壓、重度心房纖維化比例高于未復發組(P<0.01)，miR-320d表達水平低于未復發組(P<0.001)，差異有統計學意義。詳見表4。

表4 不同復發情況病人臨床資料比較

2.4 心房顫動病人術后復發的影響因素分析 Logistic回歸分析結果顯示：高血壓、重度心房纖維化、miR-320d水平是心房顫動病人術后復發的危險因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 心房顫動病人術后復發的影響因素分析

2.5 血漿外泌體miR-320d對心房顫動復發的預測價值 ROC結果顯示，miR-320d預測心房顫動病人術后復發的ROC曲線下面積(AUC)為0.799，95%CI[0.716，0.881]，靈敏度為77.3%，特異度為70.3%。詳見圖1。

圖1 miR-320d對心房顫動復發診斷價值的ROC曲線

3 討 論

心房顫動是全球范圍內常見的心律失常，確切的發病機制復雜，心房纖維化、氧化應激等均是心房顫動發生的相關因素[7]。持續的心房顫動可能引起心房結構改變，如心房心肌肥大、細胞排列紊亂及心肌間質纖維化等，稱為心房結構性重構，最終導致心房擴大[8]。心房纖維化作為心房結構重構的標志性改變，是心房顫動發生和維持的基礎，結締組織纖維化過程包括纖維成分變化和重新分布，心肌實質細胞凋亡和被替代，這一過程既是對受損傷部位的修復過程，也是調節心肌幾何結構適應新的生理功能狀態，減少新的機械、化學及電刺激過程[9]。心房顫動病人心房纖維化可增加遠期心腦血管病復發風險[10]，因此，對心房纖維化程度的判斷可預測心房顫動復發。

miR-320d屬于miR-320家族成員，定位于13號染色體(13q14.11)，miR-320家族編碼基因較少發生變異[11]。有研究表明，其與多種腫瘤有密切關系，miR-320在一些腫瘤中可抑制腫瘤發生發展，但在某些腫瘤中又促進腫瘤生長[12]。有研究顯示，miR-320b是頸動脈粥樣硬化和易損斑塊的特異性血清標志物[13]。miR-320d已證實是主動脈夾層的生物標志物，可調節血管平滑肌細胞凋亡[14]。另有研究證實，miR-320d在心房顫動小鼠中表達降低，其低表達與心房顫動心肌細胞凋亡有關[15]。

本研究結果顯示，與對照組相比，研究組血漿外泌體miR-320d表達水平、LVEF降低，LAD增大。提示血漿外泌體中miR-320d可能參與心房顫動發生，且心房顫動病人LAD增大，左心房增大，存在心房纖維化。同時結果顯示，與miR-320d高表達組相比，miR-320d低表達組心房纖維化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高。提示miR-320d低表達與重度心房纖維化有關，心房纖維化血清生物標志物水平升高提示心房纖維化程度加重，miR-320d可抑制心肌細胞凋亡，其低表達引起心肌細胞凋亡增加，細胞活力降低，參與心房纖維化的發展過程。復發組高血壓、重度心房纖維化比例高于未復發組，miR-320d表達水平低于未復發組，提示miR-320d水平與病人預后有關，miR-320d低表達、高血壓、重度心房纖維化可能提示心房顫動病人術后復發高風險。Logistic回歸分析結果顯示：高血壓、重度心房纖維化、miR-320d水平是心房顫動病人術后復發的危險因素，表明miR-320d低表達與預后不良密切相關，應關注miR-320d低表達、高血壓及重度心房纖維化病人預后情況。ROC結果顯示：miR-320d診斷心房顫動病人術后復發的AUC為0.799，靈敏度為77.3%，特異度為70.3%，提示血漿外泌體miR-320d表達水平對心房顫動病人術后復發具有一定預測價值，可作為預測心房顫動病人術后復發的潛在生物學標志。

綜上所述，心房顫動病人血漿外泌體miR-320d呈低表達，miR-320d低表達與重度心房纖維化及病人術后復發有關，是心房顫動復發的危險因素，miR-320d對心房顫動病人術后復發具有一定預測價值，可作為預測病人預后的潛在生物學標志。本研究存在不足，對miR-320d分子層面的作用機制尚未涉及，仍需進一步進行深入探討。