搜風祛痰中藥對同型半胱氨酸損傷的心肌微血管內皮細胞線粒體凋亡的影響

肖福龍，宮麗鴻

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，與冠狀動脈功能性改變即冠狀動脈痙攣統稱為冠狀動脈性心臟病(coronary heart disease，CHD)，簡稱冠心病。近年來，隨著我國國民經濟的迅速發展，人民生活方式和生活水平發生巨大變化，冠心病的患病率和死亡率也逐漸升高，已經成為我國重要的公共衛生問題。研究顯示，搜風祛痰中藥通過抑制細胞凋亡發揮穩定動脈粥樣硬化不穩定斑塊的作用，但搜風祛痰中藥對同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)損傷的大鼠心肌微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)的作用尚未明確[1-4]。本研究探討Hcy對CMECs線粒體凋亡的影響及搜風祛痰中藥的干預作用，為搜風祛痰中藥的臨床應用提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 原代大鼠CMECs，購自北京北納創聯生物技術研究院公司。

1.1.2 實驗動物 8周齡無特定病原體(SPF)級雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質量(240±20)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號：SYXK(遼)2013-0009。所用動物實驗均符合中國有關實驗動物使用和操作的倫理規則，并獲得遼寧中醫藥大學動物倫理委員會的批準(編號：21000092018010)。

1.1.3 實驗藥物 搜風祛痰中藥：全蝎5 g，蜈蚣1條，地龍20 g，陳皮15 g，半夏15 g，白術15 g，水蛭15 g，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用，由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供。

1.1.4 實驗試劑與儀器 Hcy(Sigma，69453)；CD31抗體(Servicebio，GB11063-1)；Bax抗體(Cell Signaling Technology，#2772)；Bcl-2抗體(CUSABIO，CSB-RA002611A0HU)；Cyto-C抗體(Servicebio，GB11080)；Caspase-9抗體(Cell Signaling Technology，#9508)；Caspase-3抗體(Cell Signaling Technology，#9662)；β-actin抗體(普利萊，C1845)；辣根酶標記的山羊抗兔IgG(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，SH-0031)；BCA蛋白劑量測定試劑盒(恩晶生物，E1WP2012)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(索萊寶生物，P1200)；Endothelial Cell Medium培養基(PromoCell，C-22010)；胎牛血清(Sigma-Aldrich，12007C)；EPS 600 電泳儀(Tanon，EPS 600)；化學發光成像系統(Tanon，5200)；二氧化碳培養箱(ThermoFisher，HERAcell 150i)；超凈工作臺(ThermoFisher，1287)；標準規格酶標儀(TECAN，infinite M200)；低溫離心機(Jouan SA，MR1822)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代大鼠CMECs的培養及鑒定 將購買的大鼠CMECs 在37 ℃、5%CO2條件下常規培養，當培養瓶內細胞生長融合>85%時，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，在0.25%胰蛋白酶中消化并傳代到6孔板上，然后在37 ℃孵育約48 h，使細胞黏附并鋪展在基質上。第2代～第4代用于后續實驗。倒置顯微鏡下觀察大鼠CMECs形態，利用細胞免疫熒光法對大鼠CMECs細胞膜上CD31蛋白的表達進行鑒定[5]。

1.2.2 含藥血清的制備[6]按成人與大鼠的體表面積折算系數，得出大鼠灌胃用藥量，即搜風祛痰中藥低、中、高劑量分別為4.05 g/kg、8.10 g/kg、16.20 g/kg。將40只大鼠按體重分為空白組、搜風祛痰中藥低劑量組、搜風祛痰中藥中劑量組、搜風祛痰中藥高劑量組，每組10只，分別給予生理鹽水、搜風祛痰中藥4.05 g/kg、8.10 g/kg、16.20 g/kg灌胃，連續灌胃7 d，每日2次。在灌胃第7天，給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血，存放于促凝管中。在4 ℃下，以3 000 r/min速度離心30 min，分離血清。將同組血清收集后，放在一起混勻，滅活，用過濾器濾過血清除菌，放置在-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 Hcy濃度的選擇 依據梯度稀釋法，將Hcy設置為8 mmol/L、4 mmol/L、2 mmol/L、1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L、0 mmol/L共7個濃度。顯微鏡下觀察大鼠CMECs形態，棄去培養基，加入0.25%胰酶EDTA消化液1 mL，CO2培養箱中孵育2 min。加入完全培養基，終止消化，并加完全培養基至25 mL。在培養板每孔中加入100 μL含有大鼠CMECs的完全培養基，繼續孵育24 h。棄去完全培養基，加入細胞外基質(ECM)培養基，繼續孵育16 h。棄去ECM培養基，在每板中加入7種不同濃度的Hcy，繼續孵育4 h。酶標儀檢測各組細胞OD值。

1.2.4 分組及干預方法 將正常培養的大鼠CMECs隨機分為5組。①空白對照組：正常培養的大鼠CMECs棄去原培養基，換為ECM基礎培養基繼續培養24 h；②模型對照組：正常培養的大鼠CMECs棄去原培養基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎培養基孵育 4 h，換為ECM基礎培養基繼續培養24 h；③搜風祛痰中藥高劑量組：正常培養的大鼠CMECs棄去原培養基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎培養基孵育4 h后，換為含16.2 g/kg搜風祛痰中藥的ECM基礎培養基繼續培養24 h；④搜風祛痰中藥中劑量組：正常培養的大鼠CMECs棄去原培養基，換成含1 mmol/L Hcy的ECM基礎培養基孵育4 h后，換成含8.1 g/kg搜風祛痰中藥的ECM基礎培養基繼續培養24 h；⑤搜風祛痰中藥低劑量組：正常培養的大鼠CMECs原培養基，換為含1 mmol/L Hcy的ECM基礎培養基孵育 4 h后，換成含4.05 g/kg搜風祛痰中藥的ECM基礎培養基繼續培養24 h。

1.2.5 細胞收集 對于進行蛋白免疫印跡法(Western

Blot)檢測的細胞，在藥物干預結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，吸去PBS緩沖液，直接將500 μL RIPA蛋白裂解液加入到培養孔中，4 ℃孵育10 min，收集裂解液，-20 ℃保存待用。

1.2.6 檢測指標 ①四唑鹽(MTT)法檢測各組細胞生存活性[7]：將大鼠CMECs用胰酶消化后接種于96孔板中，加入含有相應劑量藥物的培養液，每孔加入配制好的10 μL MTT貯存液。混勻后，37 ℃培養箱中孵育4 h；每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃孵育10 min；酶標儀上測定570 nm下各個樣本的OD值。②Western Blot檢測各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達：BCA法測定樣品蛋白濃度，并用無菌水調至2 μg/μL；每個樣品取總蛋白15 μg與SDS上樣緩沖液混合，95 ℃加熱變性5 min；冰上冷卻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min；取上清進行SDS-PAGE，電壓維持在100 V；電泳結束后，用濕轉法進行恒流轉膜35 min；Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST液)洗膜3次，每次5 min；加封閉液，室溫封閉1 h；TBST液洗膜1次，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜；TBST液洗膜3次，每次5 min；加入稀釋好的對應的二抗，室溫孵育1 h；TBST液洗膜3次，每次5 min；將配制好的ECL發光液加到膜上進行顯色，化學發光成像儀檢測成像結果，Image J 軟件分析條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 大鼠CMECs形態學觀察及鑒定 將購買的大鼠CMECs 培養至第5天時，可見細胞匯合成鋪路石樣，詳見圖1。CD31免疫熒光法鑒定顯示所提取的大鼠CMECs 純度大于 95%，詳見圖2。故本實驗采用穩定生長的第3代細胞進行后續實驗。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態學觀察(×200)

圖2 CD31免疫熒光法鑒定細胞(×200)

2.2 Hcy濃度的確定 大鼠CMECs鑒定后需要確定Hcy干預濃度，因此將不同濃度的Hcy分別作用于大鼠CMECs，檢測OD值變化。詳見圖3。

圖3 Hcy濃度篩選折線圖

2.3 搜風祛痰中藥含藥血清對Hcy損傷的大鼠CMECs生存活性的影響 與空白對照組比較，模型對照組、搜風祛痰中藥低劑量組、搜風祛痰中藥中劑量組、搜風祛痰中藥高劑量組CMECs生存活性OD值均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，搜風祛痰中藥低劑量組、搜風祛痰中藥中劑量組、搜風祛痰中藥高劑量組CMECs生存活性OD值均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖4。

與空白對照組比較，＊ P<0.01；與模型對照組比較，# P<0.01。圖4 各組CMECs生存活性柱狀圖

2.4 搜風祛痰中藥含藥血清對Hcy損傷大鼠CMECs、Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型對照組Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，搜風祛痰中藥中劑量組、搜風祛痰中藥高劑量組Bax、Cyto-C蛋白表達均降低，搜風祛痰中藥低劑量組、搜風祛痰中藥中劑量組、搜風祛痰中藥高劑量組Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均降低，Bcl-2蛋白表達均升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1，圖5。

表1 各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達比較(±s)

圖5 各組細胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達電泳圖

3 討 論

細胞凋亡是指生物體內一種生理性的程序性細胞死亡過程，是細胞針對所處環境因素的特定改變而產生的應答。當受到外界刺激后，線粒體內發生Ca2+沉積，三磷酸腺苷生成不足，引起線粒體凋亡，最終影響冠狀動脈微血管內皮細胞功能[8]。Bcl-2家族分子是線粒體凋亡通路的關鍵調節蛋白，主要包括抗凋亡因子Bcl-2等和促凋亡因子Bax等，其能改變線粒體膜通透性，最終引起細胞凋亡[9]。Caspases是細胞發生凋亡的關鍵環節，起始凋亡蛋白酶Caspase-9形成凋亡體，激活下游效應凋亡蛋白酶Caspases-3，通過對維持細胞結構及生命活動所必需的蛋白進行裂解，導致細胞結構的破壞及 DNA 損傷斷裂，最終引起細胞凋亡。血管內皮細胞是構成冠狀動脈內壁的主要細胞，具有分泌功能，多種原因誘導的血管內皮細胞損傷是觸發冠心病的首動因素[10]。研究表明，血瘀型冠心病病人存在凋亡相關基因Bcl-2的差異表達[11]。

冠心病屬于中醫學“胸痹心痛”范疇，風痰理論是冠心病的主要病機。現代人運動減少，飲食膏粱厚味致使脾虛生痰，百病皆由痰作祟，痰濁內生，困阻血脈，血行不暢，停滯為瘀，痰凝血瘀，痰瘀蘊結不解而生內癰毒熱，熱極生內風，風邪為百病之長，善行而數變，挾痰入絡，痰風內動[12]，筋脈失養，攣急剛勁，痹阻心脈。正如《醫方考》謂“風痰者，濕土生痰，痰生熱，熱生風也”，《東醫寶鑒·痰飲》謂“痰者，津液因熱而成，熱則津液熏蒸而稠濁故名曰痰”。故治療以搜風祛痰、祛瘀通絡為治法，予以搜風祛痰中藥，方中全蝎、蜈蚣、地龍3藥共為君藥，白術、半夏、陳皮合用共為臣藥，水蛭為佐使藥，共奏搜風祛痰、祛瘀通絡之效。

本研究結果表明，不同濃度Hcy均能夠誘導大鼠CMECs出現損傷，濃度較低時，細胞活性變化較大，說明Hcy濃度對細胞活性影響較為明顯，當Hcy濃度>2 mmol/L，曲線趨于平緩，說明Hcy濃度的增加對細胞活性的影響開始變得不明顯。再結合以往同類研究的文獻報道，因此選擇Hcy濃度為1 mmol/L時，損傷程度最適于本研究，此時細胞損傷程度較為穩定。通過檢測線粒體凋亡相關蛋白來檢測細胞凋亡，與空白對照組比較，模型對照組Bcl-2、Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均升高(P<0.01)，說明大鼠CMECs在給予Hcy干預后，促凋亡因子Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均出現上調，導致細胞凋亡活動增加，表明細胞凋亡途徑為線粒體凋亡；其中抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達亦出現上調，考慮與內皮細胞受到應激有關；與模型對照組比較，搜風祛痰中藥組Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，說明搜風祛痰中藥含藥血清均能夠通過下調Hcy損傷的大鼠CMECs凋亡相關因子中的促凋亡因子Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達、上調抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達來抑制細胞線粒體凋亡。

綜上所述，搜風祛痰中藥含藥血清能夠上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，抑制細胞線粒體凋亡，從而抑制Hcy誘導的大鼠CMECs損傷。