生脈注射液對心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體融合素2的影響及保護作用

張 婷，馬 喆，趙久麗，金秋碩，婁利霞

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)簡稱I/R損傷，是指在心肌供血中斷一定時間后恢復供血，原缺血心肌發生較供血恢復前更嚴重的損傷[1]。隨著急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發病率的逐年增加，及時、充分、持續地開通梗死相關動脈，實現有效再灌注是急性心肌梗死治療的關鍵[2]。缺血心肌得到再灌注確能改善心功能，但同時又不可避免地造成缺血再灌注損傷。臨床研究表明，缺血后再灌注在改善心肌供血的同時伴隨著一系列病理生理過程，包括氧化應激、炎癥、線粒體損傷等，最后出現不可逆的細胞焦亡、細胞凋亡和壞死，使心肌損傷范圍進一步加重[3]。因此，心肌缺血再灌注損傷的預防和治療方法的研究非常必要。

研究表明，線粒體融合素2(mitochondrial fusin 2，Mfn2)對維持正常心肌細胞生理功能具有重要意義。Mfn2在調節細胞功能方面具有多重作用，參與細胞增殖、凋亡、自噬、氧化應激損傷和線粒體融合，是缺血再灌注損傷的關鍵因子[4]。在小鼠心肌缺血再灌注模型中下調Mfn2的表達，會導致心肌細胞凋亡[5]。Mfn2作為線粒體外膜的重要組成部分，參與線粒體結構功能穩態的維持[6]。研究提示，Mfn2的表達調節是心肌缺血再灌注損傷的新的關鍵因子，通過對線粒體融合的調節可以介導心臟對急性缺血再灌注損傷的保護[7]，而其缺失則會導致線粒體結構損傷，進而導致心肌細胞功能障礙[8]。已有研究表明，發生在24 h內的凋亡會導致心肌組織發生大面積或者廣泛性的損傷，更易發生心肌功能障礙[9]。因此，如果心肌細胞凋亡能被有效抑制，那么心肌梗死導致的心臟病理生理變化及功能障礙以及缺血再灌注損傷就會相應減少。

心肌缺血再灌注損傷在中醫證型中多屬于氣陰兩虛證，心肌缺血再灌注損傷后，心肌收縮功能障礙，導致左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)降低[10]。生脈注射液(Shengmai Injection，SMI)處方來源于古方生脈散，是從紅參、麥冬、5味子中提取有效成分制成的中藥注射劑[11]。生脈注射液臨床應用于冠心病、心肌梗死、心力衰竭、休克等治療，具有益氣養陰、復脈固脫的功效。研究表明，生脈注射液可以明顯提高心肌氧化物歧化酶(SOD)水平、減少丙二醛(MDA)的產生，減輕心肌細胞缺血再灌注過程中氧化應激損傷，具有保護心功能的作用[12]。本研究擬在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，通過檢測心肌細胞凋亡、心肌組織總SOD、總MDA水平，及Mfn2 mRNA及蛋白表達情況，探討生脈注射液減輕心臟缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠18只，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養條件：動物飼養于北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室屏障級實驗動物房。相關動物實驗操作按照實驗室實驗動物操作規程進行，符合動物倫理審查要求。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 生脈注射液(國藥準字040827)購自江蘇蘇中藥業集團生物制藥有限公司；總SOD活性檢測試劑盒WST-8法(S0101S)、MDA檢測試劑盒(S0131S)購自上海碧云天生物技術有限公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測試劑盒(G3250)購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；Mfn2 antibody(12186-1-Ap)購自美國Proteintech公司；動物組織RNA提取試劑盒(DP431)、反轉錄試劑盒(KR118-02)、擴增試劑盒(FP205-02)購自北京天根生化科技有限公司；Mfn2、磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)引物購自北京諾賽基因組研究中心有限公司。

1.2.2 主要儀器 ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；Vevo高分辨率小動物超聲影像系統，TM2100型(加拿大Visual Sonics公司)；Applied Biosystems實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀，Mx3000P(美國安捷倫科技公司)；熒光顯微鏡，Scope.A1(德國Zeiss公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥 根據隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、生脈注射液組，每組6只。手術前7 d，生脈注射液組開始腹腔注射生脈注射液每天12 mL/kg，假手術組和模型組分別腹腔注射相應體積的生理鹽水。連續給藥7 d后進行心肌缺血再灌注損傷模型制備。

1.3.2 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備 大鼠實驗前禁食12 h，腹腔內注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉，仰臥位固定四肢及頭部，胸前手術備皮。記錄Ⅱ導聯心電圖。在胸骨左緣0.5 cm處，自胸骨左緣第4肋間開胸，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，分離肌層，剪斷第4肋骨，開胸，用小拉鉤牽拉胸壁，撕開心包膜，充分暴露心底部。在左心耳與肺動脈圓錐之間找到冠狀動脈左前降支，用結扎線(穿5/0縫線)在左心耳根部下方2 mm處，以深1.5～2.0 mm、寬2.0～3.0 mm

穿過心肌表層，結扎冠狀動脈左前降支。線結下置入一個直徑約1 mm乳膠管，系緊結扎線，阻斷前降支血流。結扎后，迅速將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內的空氣，關閉胸腔。阻斷左冠狀動脈30 min后，打開胸腔剪斷縫線，抽出乳膠管再灌注2 h，造成心肌缺血再灌注損傷模型，再灌注后再次記錄心電圖。模型成功標準：結扎線遠端心尖部顏色發紺，心電圖表現ST段抬高超過0.2 mV，QRS增高增寬。再灌注后抬高的ST段下降50%以上。假手術組只進行分離，不進行結扎。

1.4 觀察指標檢測

1.4.1 大鼠超聲心動圖檢測 大鼠心肌缺血再灌注術后進行超聲心動圖檢測。將大鼠仰臥位固定于鼠板，左胸部廣泛備皮，應用超聲診斷儀和高頻線陣探頭，取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導M型曲線檢測心臟結構和功能。每組原始數據均選取連續3個心動周期測量值的平均值。超聲檢測的操作采用單盲法。測量參數包括：LVEF、左室短軸縮短率(LVFS)、左室后壁舒張末厚度(LVPWTd)、左室后壁收縮末厚度(LVPWTs)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)。

1.4.2 TUNEL檢測心肌細胞凋亡 按照試劑盒說明書，大鼠心肌組織石蠟切片用多聚甲醛室溫固定30 min后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，每次5 min；每個樣本滴加蛋白酶K工作液100 μL，室溫孵育10 min后用PBS洗滌5 min；再以多聚甲醛室溫固定5 min后用PBS洗滌5 min；每個樣本滴加Equilibration Buffer 100 μL，室溫避光孵育10 min；每個樣本滴加DNA熒光染料溶液rTdT Incubation Buffer 100 μL，37 ℃避光孵育60 min；室溫浸泡所有樣本片于2X SSC溶液內10 min，重復1次后以PBS洗滌3次，每次5 min；用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封片液封片，避光保存。每個樣本取5個視野熒光顯微鏡拍照。結果用Image J軟件進行統計分析。

1.4.3 心肌組織總SOD活性檢測 取20 mg心肌組織樣品加入200 μL SOD樣品制備液冰浴下勻漿，12 000 g 4 ℃離心5 min，取上清檢測。按照說明書用96孔板設置樣品孔及空白對照孔，按照反應體系依次加入SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液、反應啟動工作液，37 ℃孵育30 min，用酶標儀在450 nm測定吸光度，記錄數值并計算抑制百分率，待測樣品中SOD酶活力單位即檢測體系中SOD酶活力單位。

1.4.4 心肌組織總MDA含量檢測 取20 mg心肌組織樣品加入200 μL裂解液冰浴下勻漿，12 000 g 4 ℃離心10 min，取上清檢測，另取2 μL上清稀釋后用2，2聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度并記錄數值。按照說明書取適量標準品用去離子水稀釋至1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L濃度，加入0.1 mL上述不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1 mL樣品用于測定；隨后加入0.2 mL MDA檢測工作液，混勻后，100 ℃或沸水浴加熱15 min，然后水浴冷卻至室溫。1 000 g室溫離心10 min，取200 μL上清加入到96孔板中，用酶標儀在532 nm測定吸光度，記錄數值進行MDA含量計算，即單位質量的蛋白含量(μmol/mg蛋白)。

1.4.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測大鼠心肌組織Mfn2 mRNA水平的表達 剪取大鼠心肌組織在冰上勻漿后，用柱式離心法提取總RNA(參考天根動物組織RNA提取試劑盒DP431說明書)，紫外分光光度計測定OD260和OD280，并計算總RNA濃度及純度；配制20 μL反應體系逆轉錄2 μg總RNA(參考天根反轉錄試劑盒KR118-02說明書)，最終得到cDNA鏈，反轉錄條件：65 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min。以cDNA為模板，采用RT-PCR法檢測目的基因的相對表達量(參考天根擴增試劑盒FP205-02說明書)，擴增條件：95 ℃ 15 min預變性，之后進行40個擴增循環：95 ℃ 10 s變性，55 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸。以GAPDH為內參基因，按照2-△△ct法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列(5′- 3′)

1.4.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測大鼠心肌組織Mfn2、Caspase-3蛋白的表達 提取大鼠心肌組織蛋白；BCA法進行蛋白定量；配制10%聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品經煮沸10 min后，各樣品每孔按照50 μg蛋白上樣。將蛋白轉至NC膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加一抗Mfn2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4 ℃冰箱孵育過夜。特異性種屬二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后洗膜，ECL超敏發光液顯色，Tanon 4600凝膠成像儀進行圖像掃描。Image J軟件進行條帶灰度值分析，以GAPDH作為內參進行數據分析。

2 結 果

2.1 3組大鼠超聲心動圖檢測結果比較 在冠狀動脈結扎30 min后灌流2 h，與假手術組比較，模型組LVEF、LVFS、LVPWTd、LVPWTs均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，LVEDV、LVESV明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，提示模型組出現心功能不全；與模型組比較，生脈注射液組大鼠LVEF、LVFS、LVPWTd、LVPWTs均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，LVEDV、LVESV明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠超聲心動圖檢測結果比較(±s)

2.2 3組大鼠心肌細胞凋亡檢測比較 本研究通過TUNEL和Caspase-3蛋白活化片段檢測大鼠心肌組織細胞凋亡。TUNEL檢測結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡比率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，提示大鼠心肌缺血再灌注損傷發生時心肌細胞凋亡增加；與模型組大鼠比較，生脈注射液組心肌細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明生脈注射液可通過抑制心肌細胞凋亡發揮心肌保護作用，減輕心肌缺血再灌注損傷。詳見圖1、表3。

圖1 TUNEL法檢測3組大鼠心肌細胞凋亡圖 (×20)(藍色為染色細胞核DAPI；綠色為TUNEL陽性反應)

表3 3組大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡率比較(±s)

Western Blot檢測結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白活化片段表達明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，生脈注射液組大鼠心肌Caspase-3蛋白活化片段表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明生脈注射液可以有效預防和減輕心肌組織缺血再灌注損傷。詳見圖2。

與假手術組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05。圖2 3組大鼠缺血再灌注心肌組織Caspase-3蛋白表達比較(A為電泳圖；B為柱狀圖)

2.3 3組大鼠心肌組織SOD活力、MDA含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠的心肌組織總SOD活力明顯降低，總MDA含量明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)，提示大鼠心肌組織缺血再灌注后，心肌細胞抗氧化能力降低，出現廣泛的氧化應激損傷；與模型組大鼠比較，生脈注射液組大鼠心肌組織總SOD活力明顯升高、總MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，表明生脈注射液對心肌組織的氧化應激損傷具有抑制作用，可以有效提高心肌細胞對氧化應激損傷的抵抗能力。詳見圖3。

與假手術組比較，＊ P<0.05，# P<0.01；與模型組比較，△ P<0.01。圖3 3組大鼠心肌組織SOD活力、MDA含量比較(n=6) (A為SOD活力變化；B為MDA含量變化)

2.4 3組大鼠心肌組織Mfn2 mRNA及蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織缺血再灌注手術后Mfn2 mRNA及蛋白表達含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組大鼠比較，生脈注射液組大鼠心肌組織Mfn2 mRNA和蛋白表達含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見圖4。

與假手術組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。圖4 3組大鼠Mfn2 mRNA及蛋白水平表達比較(n=6)(A為電泳圖；B為Mfn2 mRNA表達；C為Mfn2蛋白表達)

3 討 論

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，作為參與線粒體融合的關鍵分子，可以通過調節線粒體融合來保護心肌細胞對抗缺血再灌注損傷。研究顯示，Mfn2基因敲除小鼠由于缺乏線粒體融合作用導致線粒體網絡的碎片化，無法對抗由于心肌細胞線粒體通透性轉換孔的開放和心肌細胞的壞死，進而引發心肌細胞代謝異常，從而使心肌細胞在缺血再灌注時更易發生損傷[13-15]。研究表明，在小鼠心肌細胞缺血再灌注損傷模型中下調Mfn2的表達，會導致心肌細胞凋亡[16]。本研究結果發現，在心肌缺血再灌注損傷發生時，大鼠心肌組織內Mfn2在基因水平和蛋白表達水平較假手術組均明顯降低，而提前給予生脈注射液干預可以顯著提高大鼠心肌組織內Mfn2含量。同時發現，缺血再灌注大鼠心肌組織TUNEL檢測心肌細胞凋亡發生及Caspase-3表達較假手術組明顯升高，而生脈注射液則可顯著降低這些指標。當心肌缺血再灌注損傷發生時會發生廣泛的Caspase依賴性凋亡[17]，這與本實驗研究結果相符。

鹽酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochlorid，PHC)是一種新型抗膽堿脂能藥，多用于有機磷農藥中毒及麻醉術前給藥治療。研究表明，在缺血再灌注損傷大鼠模型中，由于氧化應激產生的大量活性氧作用于多種蛋白和脂類受體從而啟動了心肌細胞凋亡，PHC可以有效阻斷這些受體與活性氧結合來間接抑制細胞凋亡，例如其可以抑制促線粒體分裂的動力相關蛋白 1(dynamin-related protein 1，Drp1)和促進Mfn2的表達，同時發揮膽堿能抗炎通路來減少氧化應激和炎癥反應，通過減輕心肌細胞凋亡來保護心肌不受缺血再灌注損傷[18-22]。大鼠心肌組織總SOD活力及總MDA含量是反映心肌細胞氧化應激反應的重要指標，本實驗結果表明，缺血再灌注大鼠心肌組織內的總SOD活力較假手術組大鼠明顯降低，總MDA含量明顯增加，這與已有研究結論相符。生脈注射液干預可明顯改善上述指標，表明生脈注射液可以通過抑制缺血再灌注損傷時的氧化應激反應來發揮細胞保護作用。

Mfn2作為一種與動力相關的蛋白，可以有效促進線粒體融合來維持線粒體動力學的穩態，同時Mfn2也是一種多功能蛋白，參與線粒體轉運、內質網或肌漿網與線粒體的相互作用，以及細胞代謝、細胞凋亡和自噬過程[23]，而這些過程在缺血再灌注損傷的發生和發展進程中均扮演者重要的角色。因此，Mfn2參與缺血再灌注損傷機制仍需進一步深入的研究。

綜上所述，本研究表明提前給予生脈注射液可以改善大鼠缺血再灌注心肌損傷，這種心肌保護作用與增加缺血再灌注心肌組織Mfn2表達，減輕氧化應激損傷、抑制心肌細胞凋亡有關。