穿心蓮內酯對腦出血大鼠腦水腫及AQP4、NKCC1表達的影響

姜燕強，陳俊麗，陳利平，段國華，張 昆，劉亞利，劉 英

腦出血是指非外傷所致腦血管破裂導致的出血，占腦卒中病人的20%左右，具有高發病率、高致殘率、高致死率的特點，并且呈現年輕化趨勢[1]。研究表明，腦出血后1個月內死亡率超過35%，幸存病人中殘疾者超過50%[2]。腦水腫是腦出血主要并發癥之一，導致顱內壓升高、形成腦疝、腦組織壓迫性受損，是導致病人殘疾和死亡的主要原因[3]。目前，臨床治療腦出血主要采取藥物止血、降壓、保護神經及外科手術治療等，但都不能很好地控制腦水腫。因此，開發新的治療藥物和方法抑制腦出血后腦水腫，對改善腦出血預后具有重要意義。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一類位于細胞膜上的蛋白質，調控水在細胞的進出。目前，已在哺乳動物體內發現13種AQP，其中AQP4在腦組織含量最為豐富，主要分布在星形膠質細胞足突與腦血管接觸處，參與介導水在膠質細胞與血管間的跨膜轉運[4]。鈉-鉀-氯協同轉運蛋白(Na+-K+-2Cl-co-transporters，NKCC)有兩種亞型，NKCC1和NKCC2，其中NKCC1在大腦神經元和星形膠質細胞中廣泛表達，對細胞離子穩態和水轉運有重要作用[5]。

穿心蓮內酯(andrographolide，AND)是中藥穿心蓮的主要有效成分，研究表明，穿心蓮內酯對多種神經系統疾病具有治療作用，包括腦外傷、腦梗死、神經退行性病變、腦膜炎，其作用機制與其抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有關[6-9]。本研究旨在探討穿心蓮內酯對腦出血后腦水腫的影響并探索其機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 160只無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠，7周齡，體質量220～240 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(冀)2018-004，動物合格號：202004012。分籠飼養1周后進行實驗，飼養環境：25 ℃，相對濕度60%～70%，光照黑暗各12 h交替，自由進食和飲水。本實驗經武安市第一人民醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 藥物與試劑 穿心蓮內酯購自惠州市九惠制藥股份有限公司(批號：20191217)；尼莫地平(nimodipine，NMP)膠囊購自海南普利制藥股份有限公司(批號：200125)；伊文思藍(evans blue，EB)購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：W20190418)；AQP4、NKCC1、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號：bs-0634R、bs-6945R、bs-0061R、bs-0295G)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記二抗購自北京索萊寶生物科技有限公司(貨號：SF068)；2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)、增強型化學發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號：D10616、C05-07004)。

1.3 主要儀器 BN-51700型腦立體定位儀(美國Stoelting公司生產)；微量注射器(上海安亭微量進樣儀器廠生產)；SpectraMax M3型多功能酶標儀(美國BioTek公司生產)；H-7650型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM，日本日立公司生產)；CM1950型切片機(德國Leica公司生產)；Allegra 21R型低溫離心機(美國Beckman公司生產)；EG1150型包埋機(德國Leica公司生產)；SE300型蛋白質電泳儀(美國Hoefer公司生產)；VE186型轉膜儀(上海天能科技有限公司生產)；BX51TF型熒光顯微鏡(日本Olympus公司生產)。

1.4 分組、模型制備與給藥 采用隨機數字表法將160只大鼠隨機分為假手術組、模型組、穿心蓮內酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組，每組40只。除假手術組外，其他組大鼠均參照文獻[10]報道的自體血注射法制備腦出血大鼠模型：禁食禁水12 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，經左側股動脈取血后俯臥位固定于腦立體定位儀，沿正中切開頭皮和骨膜、暴露前囟，然后在中線右旁3.5 mm與前囟前0.2 mm交匯處鉆孔，通過微量注射器在腦基底節區(深度6 mm)以10 μL/min速度注射50 μL自身股動脈血，無菌骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合皮膚。造模完成后，尼莫地平 10 mg/kg組給予2 mg/mL尼莫地平溶液(灌胃體積5 mL/kg)灌胃[11]，每日1次；穿心蓮內酯 50 mg/kg組給予10 mg/mL穿心蓮內酯溶液(灌胃體積5 mL/kg)灌胃，每日1次，其中，大鼠劑量(mg/kg)=[人給藥量(mg)/人體重(kg)]×5.61，人體重以60 kg計算；假手術組和模型組給予5 mL/kg生理鹽水灌胃，每日1次。各組灌胃7 d。

1.5 采用改良神經功能缺損評分標準(modified Neureological Severity Scores，mNSS)進行神經功能缺損評分 按隨機數字表法每組各取8只大鼠，對照mNSS評分標準對大鼠神經功能進行評分[12]，得分越高則說明神經功能缺失越嚴重。

1.6 腦血腫體積的測定[11]按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝取腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h

后，通過高速冷凍切片機、以注射給藥針孔為中心連續切片，血腫為暗紅色，檢測血腫最大層面互為垂直的最大橫徑和最大縱徑長度，根據多田公式計算腦血腫體積，血腫體積=(π/6)×最大橫徑(mm)×最大縱徑(mm)×血腫層數×切片厚度(mm)。

1.7 失重法測定腦含水量 每組按隨機數字表法再各取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝取腦組織，生理鹽水沖洗并拭干，去除小腦和腦干后稱重為濕重(W濕)，置于烘箱中100 ℃烘干至恒重后稱量為干重(W干)，腦含水量(%)=(W濕-W干)/W濕×100%。

1.8 EB法測定血腦屏障(BBB)通透性 每組按隨機數字表法再各取8只大鼠，以4 mL/kg尾靜脈注射2%的EB，1 h后以3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，開胸暴露心臟，按左心室-右心耳通路由快到慢灌注300 mL生理鹽水，斷頭并剝取腦組織，切取右側半腦、研磨勻漿后加入3倍量甲酰胺溶液(濃度50%)，60 ℃孵育24 h后，3 000 r/min離心10 min取上清液，通過酶標儀檢測610 nm波長處吸光度值，根據標準曲線計算腦組織EB含量，腦組織EB含量可反映血腦屏障通透性[13]。

1.9 透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構變化 按隨機數字表法每組各取8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速在冰上取腦組織，經4 ℃生理鹽水沖洗干凈后，將腦組織置入pH 7.4、濃度3%的戊二醛溶液中固定72 h，4 ℃下經蔗糖緩沖液清洗、1%鋨酸固定1 h、乙醇和丙酮混合液梯度脫水后進行包埋，2 μm厚度切片后行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察定位，60 nm厚度超薄切片后，經醋酸鈾避光染色10 min、檸檬酸鉛染色10 min后，通過透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構變化。

1.10 免疫熒光法檢測腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達 取1.6步驟制備的腦組織冰凍切片，復溫后雙蒸水沖洗15 min，置于0.01 mol/L檸檬酸修復液中、微波修復5 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗15 min后用山羊血清封閉1 h，分別滴加AQP4、NKCC1一抗4 ℃避光孵育過夜，PBS溶液沖洗15 min后滴加FITC熒光素標記二抗室溫避光孵育2 h，PBS溶液沖洗15 min后50%甘油封片，然后通過熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達。

1.11 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達 取各組剩余的8只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死并迅速斷頭、在冰上剝取腦組織，取右腦注射給藥針孔周圍腦組織，剪碎后加入4 ℃ RIPA裂解液在冰上靜置30 min使其充分裂解，4 ℃、3 500 r/min離心10 min取上清液，4 ℃、12 000 r/min離心25 min后取沉淀，BCA法檢測總蛋白濃度、沸水浴10 min使蛋白變性后，分別取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)凝膠電泳(120 V電壓50 min，80 V電壓40 min)分離蛋白，濕法轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后置于5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加AQP4(1∶1 000)、NKCC1(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗體后4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加免疫球蛋白(IgG)二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL顯色，以目標蛋白條帶灰度值與內參(β-actin)條帶灰度值的比值計算目標蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯50 mg/kg組和尼莫地平10 mg/kg組神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與尼莫地平10 mg/kg組比較，穿心蓮內酯50 mg/kg組神經功能缺失評分、腦血腫體積明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1。

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內酯50 mg/kg組比較，# P<0.05，△ P<0.01。圖1 各組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較(n=8)(A為各組大鼠神經功能缺失評分比較；B為各組大鼠腦血腫體積比較；C為各組大鼠腦含水量比較)

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織EB含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組EB含量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與尼莫地平 10 mg/kg組比較，穿心蓮內酯 50 mg/kg組EB含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見圖2。

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內酯50 mg/kg組比較，# P<0.01。圖2 各組大鼠血腦屏障通透性比較(n=8)

2.3 各組大鼠血腦屏障超微結構比較 假手術組大鼠血腦屏障的基膜結構完整，緊密連接結構(tightjunction protein systerm，TJPs)致密，未見異常；模型組血腦屏障可見基底膜薄厚不均勻、膨大，有斷裂現象，緊密連接結構疏松，內皮細胞皺縮等超微結構病變；與模型組比較，穿心蓮內酯 50 mg/kg組和尼莫地平10 mg/kg組血腦屏障超微結構病變呈不同程度改善，其中穿心蓮內酯 50 mg/kg組效果更為明顯。詳見圖3。

圖3 各組大鼠血腦屏障超微結構(×15 000，n=8)(黑色箭頭指示為基底膜；橙色箭頭指示為緊密連接結構；紅色箭頭指示為內皮細胞)

2.4 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達量明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯 50 mg/kg組和尼莫地平 10 mg/kg組AQP4、NKCC1蛋白表達量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與尼莫地平 10 mg/kg組比較，穿心蓮內酯 50 mg/kg組AQP4、NKCC1蛋白表達量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖4～圖7。

圖4 各組大鼠腦組織AQP4表達免疫熒光圖(×100，n=8)

圖5 各組大鼠腦組織NKCC1表達免疫熒光圖(×100，n=8)

圖6 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達條帶圖(n=8)(A為假手術組；B為模型組；C為穿心蓮內酯50 mg/kg組；D為尼莫地平10 mg/kg組)

與模型組比較，＊ P<0.01；與穿心蓮內酯50 mg/kg組比較，# P<0.01。圖7 各組大鼠腦組織AQP4、NKCC1蛋白表達比較(n=8)

3 討 論

腦出血是一種起病急、進展快且致殘、致死率較高的腦血管疾病，腦水腫引發顱內壓升高及繼發性腦疝是導致腦出血病人殘疾和死亡的主要原因。目前，臨床上對于腦出血的治療方案均不能很好地控制腦水腫，是腦出血治療中仍待解決的難題[14]。

中醫藥是具有獨特理論及技術方法的醫藥學體系，具有悠久的應用歷史。腦出血在中醫屬于“中風”范疇，“氣虛血瘀、痰瘀阻絡”是其主要病機[15]。中醫典籍中沒有關于腦水腫的確切記載，根據其癥狀當屬于“中風”“真頭痛”“癇病”等范疇[16]。但關于腦水腫的相關病機，中醫典籍《證治準繩》中記載“瘀則液外滲，則成水也”，《血證論》中記載“瘀血既久，化為痰水”。中藥穿心蓮以爵床科植物穿心蓮干燥地上部分入藥，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血消腫之功效。穿心蓮內酯為穿心蓮的主要有效成分，化學結構屬于二萜類內酯化合物，具有良好的抗炎活性，目前，臨床上主要用于上呼吸道感染、細菌性痢疾的治療[17]。尼莫地平為鈣離子拮抗劑類降壓藥，是臨床防治蛛網膜下腔出血等急性腦血管病的常用藥物[18]。本實驗采用自體血注射法制備腦出血大鼠模型并給予穿心蓮內酯進行治療，以尼莫地平作為陽性對照藥物，研究發現，經穿心蓮內酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積和腦含水量，并且穿心蓮內酯組對神經功能、腦血腫體積的影響優于尼莫地平組，提示穿心蓮內酯對大鼠腦出血后腦水腫和神經功能損傷具有抑制作用。

腦水腫根據誘發機制可分為兩大類：細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。研究發現，細胞毒性腦水腫在腦出血早期(腦出血后2～24 h)占主導地位，期間主要引發星形膠質細胞水腫，尤其是毛細血管周圍的星形膠質細胞足突，也是AQP4高表達位點[4]。黃娟[19]的研究表明，AQP4對細胞毒性腦水腫具有重要的調控作用。Manley等[20]研究發現，AQP4 缺失的小鼠細菌性腦膜炎或局灶性腦缺血等所引起的細胞毒性腦水腫明顯減輕。血管源性腦水腫在腦出血晚期(腦出血24 h后)占主導地位，引發細胞間隙腫脹，與血腦屏障通透性增加密切相關[21]。血腦屏障是存在于腦組織與血液間的一道選擇性生理屏障，能夠阻止水溶性及部分脂溶性物質進入腦組織，對維持腦內環境穩態具有重要作用。病理學研究發現，腦水腫組織中AQP4表達明顯上調，其參與各種原因所致腦水腫的形成[22]。魏二佳等[23]研究表明，AQP4表達量與腦含水量變化呈正相關，AQP4參與腦出血所致腦水腫的形成過程。NKCC1過度表達將會導致細胞腫脹和組織水腫，Gong等[24]研究發現，抑制NKCC1則能夠減輕腦水腫。本研究結果顯示，腦出血模型大鼠血腦屏障通透性明顯升高，血腦屏障可見基底膜薄厚不均勻、膨大、斷裂現象，緊密連接結構疏松，內皮細胞皺縮等超微結構病變，與王麗琴等[25]研究報道一致。進一步研究發現，經穿心蓮內酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠血腦屏障通透性，明顯改善血腦屏障超微結構病變，明顯降低腦組織AQP4、NKCC1表達，與王橋生等[26]研究報道一致，并且穿心蓮內酯上述作用優于尼莫地平組，提示穿心蓮內酯對腦出血大鼠腦水腫的抑制作用可能與下調AQP4和NKCC1表達、降低血腦屏障通透性有關。

綜上所述，穿心蓮內酯具有減輕腦出血大鼠腦水腫的作用，其機制可能與下調AQP4和NKCC1表達、降低血腦屏障通透性有關。本研究結果提示，穿心蓮內酯可作為腦出血的治療藥物，但AQP4、NKCC1對血腦屏障通透性的影響機制還有待于進一步研究。