血漿miR-378、HSF1與慢性心力衰竭病人左心室重構的相關性分析

朱辰蕊，高競生

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由于心肌梗死、心肌病或血流動力學負荷過重等原因造成心肌損傷，引起心肌結構和功能的改變，最后導致心室泵血或充盈功能低下的臨床綜合征，臨床表現為呼吸困難、咳嗽和液體潴留[1]。研究發現，心室重構在CHF的發生、發展和臨床轉歸中發揮重要作用[2]。臨床上雖然可以通過彩色超聲多普勒評價心室重構、心功能，但其反映的是心臟形態學指標的變化，無法反映CHF的致病原因。因此，探究影響CHF發生左心室重構(left ventricular remodeling，LVR)的影響因素并分析該因素與左心室重構的相關性，可能對深入了解CHF合并左心室重構具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種小分子的非編碼RNA，可以通過抑制翻譯、誘導降解等方式參與多種基因調控的表達[3]。研究發現，miRNA-378是心肌肥大的調節劑，通過在不同水平上抑制促分裂原活化蛋白激酶信號途徑發揮其活性，并對心臟產生明顯的抗纖維化作用[4]。熱休克轉錄因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)是一種心臟保護因子，可減輕心臟肥大和心肌纖維化，并抵抗缺血損傷和心臟壓力超負荷[5]。本研究通過檢測CHF合并左心室重構病人血漿miR-378、HSF1水平，分析二者與CHF病人左心室重構的相關性，以期為臨床預防、延緩CHF病人左心室重構提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年5月—2019年5月于唐山市開灤總醫院心內科住院治療的CHF病人137例作為CHF組，其中男71例，女66例，年齡40～74(55.18±8.22)歲。診斷標準：符合《2016年歐洲心臟病學會急慢性心力衰竭診斷與治療指南》中的診斷標準[6]。依據美國紐約心臟病協會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級[7]標準對CHF病人進行分級，其中Ⅰ級或Ⅱ級45例，Ⅲ級50例，Ⅳ級42例。另選取同期因急性心肌梗死于本院住院治療的病人60例作為對照組，其中男32例，女28例，年齡43～70(55.36±8.51)歲。兩組年齡、性別構成比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準并通過后實施，病人及家屬均知情同意并簽署知情同意書，研究方法符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①具有完整的診斷資料且病情診斷明確；②自愿參與且中途無退出研究者。排除標準：①曾行冠狀動脈支架植入等心臟手術者；②嚴重肝、腎功能不全者；③合并急、慢性感染病者；④自身免疫性疾病者；⑤復發、難治性室性心律失常者。

1.3 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑(Trizol試劑)(貨號：MN562J2)、逆轉錄試劑盒(貨號：J6547M)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：N5643MJ)均購自美國Sigma公司；逆轉錄PrimeScript RT試劑盒(貨號：ND6527J)、SYBR Premix ExTaq試劑盒(貨號：GH8935K)均購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；miR-378及內參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成；人HSF1酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：QCH0905)購自上海欽誠生物科技有限公司；qRT-PCR分析儀(型號：YFGB1022)購自日本Olympus公司；彩色多普勒超聲心動儀(型號：HP-Sonos5500型)購自美國惠普公司。

1.4 方法

1.4.1 血漿樣本的采集與保存 所有病人均于入院后抽取肘靜脈血5 mL，置于含枸櫞酸鈉抗凝劑的抽血管內上下顛倒混勻，靜置30 min，室溫條件下3 000 r/min，離心15 min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 血漿HSF1水平檢測 從-80 ℃冰箱中取出凍存血漿樣本，解凍，采用ELISA法測定血漿HSF1的水平。所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行。

1.4.3 血漿miR-378表達水平檢測 qRT-PCR法測定血漿miR-378表達水平。按照RNA試劑盒說明書提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA。參照實時熒光定量PCR試劑盒說明進行實時熒光定量PCR反應，引物序列見表1。反應體系為20 靗：SYBR Premix 10 靗，cDNA 1 靗，H2O 8 靗，正、反向引物各0.5 靗。反應程序：95 ℃預處理20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。以U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算血漿miR-378相對表達水平。

表1 miR-378、U6引物序列(5′-3′)

1.4.4 超聲心動圖檢查 病人左側臥位，連接心電圖，根據美國超聲心動圖學會推薦的方法對反映病人心室重構的指標進行檢測[8]，測定并記錄左心室重量指數(left ventricular mass index，LVMI)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)、室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)。根據Devereux等[9]公式計算，LVMI=左室質量(logical volume manager，LVM)/體表面積(body surface area，BSA)，其中LVM=1.04[(IVST+LVPWT+LVEDD)3-LVEDD3]-13.6，BSA=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)-0.152 9。所有參數均測量5個心動周期，取其均值。

2 結 果

2.1 兩組血漿miR-378、HSF1水平比較 與對照組比較，CHF組心功能Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級病人血漿miR-378、HSF1水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Ⅰ級或Ⅱ級病人比較，CHF組心功能Ⅲ級、Ⅳ級病人血漿miR-378、HSF1水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Ⅲ級病人比較，CHF組心功能Ⅳ級病人血漿miR-378、HSF1水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血漿miR-378、HSF1水平比較(±s)

2.2 兩組超聲心動圖左心室重構指標LVMI、LVEF、LVEDV水平比較 與對照組比較，CHF組心功能Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級病人LVMI、LVEDV水平明顯升高，LVEF水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Ⅰ級或Ⅱ級病人比較，CHF組心功能Ⅲ級、Ⅳ級病人LVMI、LVEDV水平明顯升高，LVEF水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Ⅲ級病人比較，CHF組心功能Ⅳ級病人LVMI、LVEDV水平明顯升高，LVEF水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組超聲心動圖左心室重構指標LVMI、LVEF、LVEDV水平比較(±s)

2.3 血漿miR-378、HSF1水平與左心室重構指標LVMI、LVEF、LVEDV的相關性分析 Pearson法分析相關性顯示，CHF組病人血漿miR-378、HSF1水平與LVMI、LVEDV呈負相關(P<0.05)，與LVEF呈正相關(P<0.05)。詳見表4。

表4 血漿miR-378、HSF1水平與左心室重構指標LVMI、LVEF、LVEDV的相關性(r值)

2.4 CHF病人左心室重構指標LVMI多元線性逐步回歸模型分析 以CHF病人左心室重構敏感指標LVMI值為因變量，以血漿miR-378、HSF1為自變量，進行多元線性逐步回歸分析。結果顯示，血漿miR-378、HSF1是LVMI的影響因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 CHF病人左心室重構指標LVMI多元線性逐步回歸模型分析

3 討 論

CHF是一種以心臟結構改變或功能異常造成心室充盈和射血能力降低的復雜臨床綜合征，尤其是老年人群發病率較高，一般病程較長。心室重構是心肌細胞和細胞間基質成分在特定刺激下發生的心室僵硬度增加、心肌收縮力降低的變化，是CHF的重要臨床病理基礎[10]。心力衰竭長期預后較差，給病人及其家庭帶來沉重的經濟負擔。因此，探究心力衰竭的致病因素對疾病的早期診斷和防治具有重要意義。

miRNA是真核生物體內一類約有22個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過堿基互補配對與靶基因mRNA的3′端非編碼區結合，促進靶基因的降解或抑制轉錄后翻譯[11]。研究發現，腎臟同種異體移植功能障礙的典型特征是腎間質纖維化，可能是由于腎移植過程中的缺血再灌注損傷引起，miRNA-378是一種促血管生成因子，可預防腎移植過程中的缺血再灌注損傷[12]。近年來研究發現，miRNA-378與心血管疾病密切相關，如與野生型小鼠相比，miRNA-378基因敲除小鼠表現出嚴重的心臟纖維化，從而應對胸主動脈收縮引起的心臟超負荷[13]。HSF1是熱應激后激活的熱休克基因的轉錄因子，可以和多種熱休克蛋白結合形成非活性單體存在于細胞質中。在運動引起的心臟肥大人群中HSF1的激活被抑制，導致心臟出現嚴重的損傷，這一過程被證明是從適應性心臟肥大過渡為適應性不良性心力衰竭的關鍵因素[14]。研究證明，持續的壓力過載可誘發不良心臟重塑并伴隨心肌肥大和纖維化，最終導致收縮功能障礙和心臟衰竭，心臟纖維化可以導致適應不良性左心室重構，其特征是成纖維細胞的積累和細胞外基質蛋白的過量沉積，過度的心肌纖維化是心臟重構和心力衰竭發展的主要病理過程[15]，因此，預防其發生很重要。本研究發現，與對照組比較，CHF組心功能Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級組病人血漿miR-378、HSF1水平依次降低，提示血漿miR-378、HSF1水平降低與CHF并發左心室重構的發生發展有關，隨疾病進展其表達水平明顯改變。

LVMI、LVEF、LVEDV是評價左心室的質量的重要參數，其中LVEF是指每搏心輸出量占左心室舒張末容量的百分數，也是臨床心臟影像學最重要且最常用的參數，與心臟病的死亡率密切相關，可以預測愈后，衡量治療效果，是心臟病診斷治療的最重要指標[16]。本研究發現，與對照組比較，CHF組心功能Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級病人LVMI、LVEDV水平依次升高，LVEF水平依次降低，提示CHF合并左心室重構病人隨心功能等級的增加，心臟發生了更嚴重的心室重構，并伴隨嚴重的心臟收縮功能降低和心功能障礙。進一步經Pearson法分析顯示，CHF組病人血漿miR-378、HSF1水平與LVMI、LVEDV呈負相關，與LVEF呈正相關，提示血漿miR-378、HSF1水平降低可能在心室重構過程中發揮重要作用，但其具體機制有待進一步研究。本研究對CHF合并左心室重構病人LVMI值進行多元線性逐步回歸模型分析，血漿miR-378、HSF1對LVMI值有影響(P<0.05)。提示血漿miR-378、HSF1水平降低與CHF病人心室重構及心功能損傷有關，可能作為反映CHF病人心室重構及心功能損傷的重要指標，對臨床評估CHF病人心室重構有一定意義。

綜上所述，血漿miR-378、HSF1水平降低可能與CHF病人左心室重構的發生發展有關，可作為臨床診斷CHF病人發生左心室重構及評估病情嚴重程度潛在標志物。但本研究仍存在不足：未選取體檢正常人群作為健康對照組進行分析，下一步將增加此類人群作為觀察對象，進一步分析血漿miR-378、HSF1與慢性心力衰竭病人左心室重構的關系，以得到更加可靠的結論；本研究并未對血漿miR-378、HSF1的相互作用進行研究，二者可能存在調控關系，今后需進行進一步的深入研究。