PCI術后血清miR-9、miR-204表達水平對急性冠脈綜合征病人預后的預測價值

萬 榮，宋春慧，宋 志

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是缺血性心血管疾病，具有發病急、病死率高的特點，嚴重影響病人生命安全及生存質量[1]。目前，臨床多采用經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)手術治療ACS，但病人仍易再發生不良急性事件[2]，臨床仍缺乏有效監測ACS病人介入治療前后病情變化的生物指標。研究發現，微小RNA(microRNA，miRNA)在基因轉錄及表達過程中有調控作用，參與ACS的發生發展[3]，其中微小RNA-9(miRNA-9，miR-9)在ACS中表達下調，其可能通過抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，促進血管重塑，進而在ACS發病過程中發揮重要作用[4]；另外，miR-204-5p是微小RNA-204(miRNA-204，miR-204)其中一員，在ACS病人中表達失調，miR-204-5p有望成為診治ACS的靶標[5]。但血清miR-9、miR-204在ACS病人中PCI治療前后的情況鮮有報道。本研究通過觀察血清miR-9、miR-204在ACS病人PCI治療前后的變化，記錄1年內ACS病人發生主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)情況，旨在分析miR-9、miR-204與ACS病人發生MACE的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月—2019年1月于棗莊礦業集團中心醫院就診并進行介入治療的123例ACS病人(ACS組)，其中男94例，女29例；年齡47～73(65.44±10.87)歲；收集病人左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、紐約心臟病協會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高血壓、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、糖尿病、總膽固醇(total cholesterol，TC)、ACS病人類型、PCI術中植入支架數等情況。選取同期121名體檢健康者進行對照研究(健康組)，其中男96名，女25名；年齡47～73(64.98±10.77)歲。健康體檢者均進行病史詢問，胸片、心電圖、心臟及腹部彩超等檢查，排除高血壓、糖尿病、冠心病等疾病。健康組與ACS組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象或其家屬均知情同意并簽署知情同意書，且本研究獲得醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 診斷標準 參考中國醫師協會急診醫師分會制定的《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》[6]有關ACS的相關診斷標準進行判定。

1.3 納入與排除標準 納入標準：所有病人均符合ACS診斷標準；冠狀動脈造影顯示存在明確血管病變；心電圖出現連續兩個或以上導聯典型心肌缺血改變。排除標準：合并肺源性心臟病、先無性心臟病、心臟瓣膜病、心包疾病等其他器質性心臟病者；合并結締組織病、嚴重肝臟疾病、自身免疫性疾病者；合并全身各系統腫瘤、甲狀腺功能異常者；合并梗阻性腎病、腎炎、泌尿系統感染者。

1.4 試劑與儀器 TRIzol 試劑(貨號：BYX1617P)購于常州貝源鑫生物科技有限公司，microScript microRNA cDNA Synthesis Kit(貨號：NGB-54415)購于艾美捷科技有限公司，Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit(貨號：638315)購于上海善然生物科技有限公司。全自動生化分析儀(型號：DXC600)購于北京泰林東方商貿有限公司；超微量紫外分光光度計(型號：NanoDrop One-w)購于北京智杰方遠科技有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：ABI StepOnePlus)購于上海奧陸生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 標本采集 采集ACS病人入院時、介入治療后3 d內靜脈血4～5 mL，健康體檢者空腹靜脈血4～5 mL，室溫下凝集30 min，4 ℃ 6 500 r/min離心8 min，分離血清，-80℃冰箱中凍存，待檢測。

1.5.2 qRT-PCR法檢測血清miR-9、miR-204表達水平 解凍血清樣本，以TRIzol試劑抽提總RNA。根據microScript microRNA cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，按照TaqMan?Gold RT PCR試劑盒說明書配制反應體系，進行PCR反應。miR-9、miR-204均以U6為內參基因，引物序列見表1。以2-△△CT法計算miR-9、miR-204相對表達量。

表1 miR-9、miR-204及U6的引物序列(5′-3′)

1.6 隨訪 ACS病人介入治療后出院，采用門診隨訪、電話或再次入院等方式隨訪1年，記錄發生MACE情況。在隨訪期間有93例ACS病人未發生MACE(非MACE組)，有30例ACS病人發生MACE(MACE組)，其中發生嚴重室性心律失常3例，發生充血性心力衰竭再次入院10例，心源性猝死2例，再次發生非致命性ACS15例(再次行冠狀動脈搭橋手術4例，再次行冠狀動脈支架手術9例，再次心絞痛行血運重建術2例，予以藥物強化治療)。

2 結 果

2.1 健康組與ACS組血清miR-9、miR-204水平比較 與健康組比較，ACS組病人治療前血清miR-9、miR-204水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 健康組與ACS組血清miR-9、miR-204水平比較(±s)

2.2 ACS病人治療前后血清miR-9、miR-204水平比較 ACS組病人治療后血清miR-9、miR-204水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 ACS病人治療前后血清miR-9、miR-204水平比較(±s)

2.3 兩組不同預后ACS病人臨床資料及治療后血清miR-9、miR-204表達水平比較 非MACE組與MACE組比較，NYHA心功能分級中Ⅱ級或Ⅲ級比例、高血壓比例、治療后血清miR-9、miR-204表達水平，差異均有統計學意義(P<0.05)，年齡、男女比例、LVEF、LDL-C水平、HDL-C水平、糖尿病比例、TC水平、ACS亞型比例、PCI術中植入單枚或多枚支架比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 不同預后ACS病人臨床資料及治療后血清miR-9、miR-204表達水平比較(±s)

2.4 Logistic回歸分析ACS病人發生MACE的影響因素 以ACS病人是否發生MACE為因變量，以治療后miR-9水平、miR-204水平、NYHA心功能分級、高血壓為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，NYHA心功能分級、高血壓是ACS發生MACE的危險因素(P<0.05)，miR-9、miR-204是ACS病人發生MACE的保護因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 ACS病人發生MACE影響因素的Logistic回歸分析

2.5 治療后血清miR-9、miR-204水平對ACS病人發生MACE的預測價值 ROC曲線顯示，治療后血清miR-9水平預測ACS病人發生MACE的ROC曲線下面積(area under curve，AUC)為0.801，95%CI(0.749，0.864)，截斷值為0.85，其靈敏度、特異度分別為86.2%、67.8%；治療后血清miR-204水平預測ACS病人發生MACE的AUC為0.791，95%CI(0.734，0.848)，截斷值為0.82，其靈敏度、特異度分別為84.6%、66.9%；治療后血清miR-9、miR-204水平聯合預測ACS病人發生MACE的AUC為0.889，95%CI(0.848，0.931)，對應靈敏度、特異度分別為84.6%、81.0%。詳見圖1。

圖1 治療后血清miR-9、miR-204水平預測ACS病人發生MACE的ROC曲線

3 討 論

心血管疾病是世界范圍內死亡的主要病因，其中動脈粥樣硬化性心血管疾病即冠心病對死亡率影響最大，ACS是冠心病的危重類型，對人類健康構成極大威脅[7-8]。此外，PCI手術治療可重建血流，減少心肌缺血梗死面積，是治療ACS的常用方法，但病人術發生MACE概率仍較高，因此，尋找可用于監測ACS病情變化及預后評估的指標并及時干預，對改善ACS病人預后具有重要意義。

miRNA廣泛分布于組織、器官及外周血液中，可在免疫調節、炎癥反應、信號傳導、血管重塑等生物學過程中發揮重要調節作用，與心肌梗死、ACS等疾病密切相關[9-10]。研究發現，血清miR-186-5p水平在ACS病人入院時明顯高于健康對照組，其表達水平經冠脈介入治療后明顯降低，miR-186-5p可能通過調節葡萄糖代謝及炎癥反應，進而影響ACS發病進程，其表達水平有助于監測ACS病人介入治療后的臨床狀況及評估預后[11]；另外，miR-146a在ACS病人血清中水平升高，PCI術后，其水平降低，miR-146a可作為監測ACS病情變化及預后評估的指標[12]。以上研究表明，異常表達的miRNA與ACS病變過程密切相關，miRNA具有評估ACS病情及預后的潛在價值。既往研究顯示，miR-9-3p在冠心病中呈低表達，其通過影響內皮細胞增殖及遷移，進而在冠心病發展進程中發揮作用[13]；另外，miR-9-5p在心肌梗死中表達異常，miR-9-5p可通過抑制線粒體凋亡途徑，降低缺血損傷，抑制心肌細胞凋亡，從而在心肌梗死疾病進展中發揮作用[14]。以上研究表明，表達失調的miR-9與缺血類心血管疾病有關。本研究中ACS組病人治療前血清miR-9水平明顯低于健康組，與相關研究結果[3]一致，且ACS病人經介入治療后，血清miR-9水平明顯上調，提示miR-9可能參與并影響ACS疾病發展過程，其水平有利于評估ACS病情及預后。推測miR-9可能通過影響內皮細胞增殖、遷移、血管重塑、動脈粥樣硬化斑塊形成等生理病理過程，從而在ACS疾病進展中發揮一定作用，但具體機制有待進一步探究。Wu等[15]應用定量RT-PCR技術對生物信息學分析發現miR-204與心肌梗死病理發展關系密切，具有診斷心肌梗死的潛在價值；此外，miR-204在心肌損傷的小鼠中呈低表達，其可能影響心室重構及心功能[16]。本研究中ACS組病人治療前血清miR-204水平明顯降低，經介入治療后，miR-204水平明顯升高，提示miR-204可能與ACS發生發展相關。推測miR-204作為miRNA成員，其可能通過影響細胞凋亡、內皮細胞增殖、遷移過程，進而在ACS發生發展中發揮抑制作用，其機制仍需深入研究證實。

本研究中MACE組病人心功能分級Ⅱ級或Ⅲ級比例、高血壓比例均明顯高于非MACE組，治療后血清miR-9、miR-204表達水平明顯低于非MACE組，提示心功能分級、高血壓血清miR-9、miR-204表達水平均可能與ACS病人PCI治療后預后情況有關。本研究顯示，血清miR-9、miR-204診斷ACS病人發生MACE的AUC分別為0.801、0.791，當血清miR-9相對表達量低于0.85或miR-204低于0.82時，ACS發生不良預后概率增加，提示血清miR-9、miR-204對ACS病人發生MACE均有一定預測價值，血清miR-9、miR-204聯合預測ACS病人發生MACE的AUC為0.889，相應靈敏度為84.6%，特異度為81.0%，提示兩者聯合可有效提高預測ACS病人發生MACE的特異度，增加ACS病人預后診斷效能。進一步研究發現，NYHA分級、高血壓是ACS發生MACE的危險因素，miR-9、miR-204是ACS發生MACE的保護因素，提示NYHA心功能分級越高、治療后血清miR-9、miR-204水平越低，合并高血壓均會增加ACS病人發生MACE的風險，及時確定上述指標，有助于早期評估ACS病人預后。

綜上所述，血清miR-9、miR-204在ACS病人中表達下調，經PCI治療后，兩者水平升高，與預后相關，檢測血清miR-9、miR-204水平可輔助監測ACS病情及預后評估。但本研究未深入探究miR-9、miR-204影響ACS病人預后的具體機制，后期將進一步研究。