ApoE基因526C>T多態(tài)性與瑞舒伐他汀調(diào)脂療效及hs-CRP的關(guān)系

李汶嘉，鄭文玲，楊 偉

高脂血癥特別是高膽固醇血癥是冠心病的危險因素之一，隨著長期膽固醇水平的異常升高，病人發(fā)生冠心病概率明顯上升[1]。目前，臨床治療冠心病、動脈粥樣硬化最常用的藥物是他汀類調(diào)脂藥，該類藥物在降脂及降低臨床不良事件發(fā)生率方面存在一定的個體差異[2]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)界對遺傳藥理學(xué)不斷深入的研究，越來越多的研究表明，脂代謝相關(guān)基因多態(tài)性會造成蛋白結(jié)構(gòu)域及功能的改變，從而影響他汀類藥物的降脂效果[3]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是常見的血漿脂蛋白之一，其主要作用是調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，而這一功能的實現(xiàn)依賴于低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)。臨床實驗表明，同他汀類藥物一樣，ApoE基因多態(tài)性對各種人群自身的調(diào)脂效能均存在一定的影響，但不同的是，他汀類藥物調(diào)節(jié)血脂的主要途徑是通過競爭性抑制對羥甲戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-m ethylglutaryl eoenzyme A，HMG-CoA)還原酶活性實現(xiàn)[4]。但值得注意的是，ApoE基因與不同亞型LDLR的結(jié)合方面同樣存在差異[5]，但這種差異與HMG-CoA還原酶活性的改變是否同期尚不清楚。超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)亦參與并促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，高水平的C-反應(yīng)蛋白(CRP)是導(dǎo)致冠心病發(fā)生的獨立危險因素，其濃度水平和他汀類藥物治療冠心病病人的療效及預(yù)后密切相關(guān)[6]。本研究就ApoE基因526C>T多態(tài)性與瑞舒伐他汀調(diào)脂療效及hs-CRP的關(guān)系進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年3月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的高脂血癥病人155例進行前瞻性研究，其中男 85 例，女70例，年齡25～79(52.9±10.2)歲。入選病人均保持低脂飲食，口服瑞舒伐他汀20 mg，每晚1次，連續(xù)服用12周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有病人及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《2014年中國膽固醇教育計劃血脂異常防治專家建議》[7]中高脂血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有肝、腎功能異常者；合并糖尿病、內(nèi)分泌功能紊亂者；合并其他臟器腫瘤者；合并精神疾病者。

1.3 試劑及儀器 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT and quantitative real-time PCR，RT-PCR)相關(guān)試劑、總RNA提取試劑均由北京全式金公司提供；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增儀由杭州朗基科學(xué)儀器有限公司提供；全波長酶標(biāo)儀、凝膠成像儀由美國Bio-RAD公司提供、血生化指標(biāo)采用奧林巴斯全自動生化分析儀進行檢測。

1.4 試驗方法 于治療前、治療后的第12周末分別采集空腹12 h靜脈血5 mL并分離血清。

1.4.1 DNA提取 人血DNA提取試劑盒提取病人的血液DNA后，利用PCR-熒光探針法對ApoE基因進行測定。

1.4.2 ApoE基因型檢測 采用等位基因特異性多重PCR技術(shù)對ApoE基因進行分型。序列：P1為5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′，P2為5′-ATGCCGATGA CCTGCAGAATC-3′，分別檢測158位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；P3為5′-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3′，P4為5′-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3′，分別檢測112位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；P5為5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGC-3′，為公共引物。其中，ApoE基因有兩個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，分別為氨基酸序列第112位(c.388 T>C)為E3/2組，第158位(c.526 C>T)為E4/3組，其余的為E3/3組。P1、P2與P5間擴增片斷大小為451 bp，P3、P4與P5間擴增片斷為588 bp。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，各個樣本分為A管、B管，均含12.5 mL的2×PCR Master Mi，P5共20 pmol。其中A管加入15 pmol的P1、10 pmol的P3；B管加入15 pmol的P2，10 pmol的P4。反應(yīng)條件為：95 ℃、5 min預(yù)變性，然后在95 ℃、45 s，62 ℃、45 s，72 ℃、45 s，共循環(huán)35次，最后72 ℃、5 min延伸，產(chǎn)物在采用含溴化乙錠(EB)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.5 觀察指標(biāo) 對比觀察治療前、治療12周后ApoE基因各組血清hs-CRP、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol，LDL-C)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、載脂蛋白A1(apolipoprotein A1，ApoA1)水平。

2 結(jié) 果

2.1 不同ApoE基因型組間治療前血脂水平比較 治療前，E3/2組血清TC、LDL-C水平低于E3/3組和E4/3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E3/3組血清TC、LDL-C水平低于E4/3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 不同ApoE基因型組間治療前血脂水平比較(±s)

2.2 不同ApoE基因型組間治療12周后與治療前血脂水平差值比較 治療12周后，E3/2組血清TC、LDL-C水平下降幅度大于E3/3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同ApoE基因型組間治療12周后與治療前血脂水平差值比較(±s)

2.3 不同ApoE基因型組間治療前后hs-CRP水平比較 治療前，E4/3組血清hs-CRP水平低于E3/2組和E3/3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，3組血清hs-CRP水平均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，E4/3組血清hs-CRP水平與E3/2組、E3/3組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 不同ApoE基因型組間治療前后hs-CRP水平比較(±s) 單位：mg/L

3 討 論

ApoE基因具有顯著的遺傳多態(tài)性，常見異構(gòu)體有ApoE2、ApoE3和ApoE4，這3個ApoE基因的突變體為ApoE2和ApoE4，野生型為ApoE3，ApoE基因不僅參與神經(jīng)組織的免疫調(diào)節(jié)和再生，還參與水解脂肪酶的激活和血小板聚集的抑制[8]。他汀類藥物作為HMG-CoA還原酶抑制劑，可明顯降低LDL-C水平，但有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物治療高脂血癥的療效存在較大個體差異，調(diào)整藥物劑量后，仍有約33%的病人無法達到預(yù)期療效，可能與藥物轉(zhuǎn)運蛋白、藥物代謝酶、藥物靶點分子基因或藥物受體發(fā)生變異有關(guān)[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，治療前，E3/2組血清TC、LDL-C水平低于E3/3和E4/3組(P<0.05)，E3/3組血清TC、LDL-C水平低于E4/3組(P<0.05)；治療12周后，E3/2組血清TC、LDL-C水平下降幅度大于E3/3組(P<0.05)。可能與E3/2組病人較E3/3組病人的低密度脂蛋白膽固醇(LDL)受體親和力低，極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein，VLDL-C)的殘基清除速度低，代償性LDL受體合成增加，進而激活HMG-CoA還原酶活性有關(guān)，最終的綜合效應(yīng)表現(xiàn)為LDL受體親和力低病人通過他汀類藥物治療的效果更好；但E4/3中并未發(fā)現(xiàn)與之相反的結(jié)論，可能與E4、E2等位基因效能較弱，且脂代謝過程復(fù)雜，他汀類藥物治療結(jié)果容易受到環(huán)境因素的影響有關(guān)[11]。

ApoE基因多態(tài)性和炎癥反應(yīng)亦相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，治療前，E4/3組血清hs-CRP水平低于E3/2組和E3/3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療后，E4/3組血清hs-CRP水平與E3/2組、E3/3組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明E4等位基因?qū)θ鹗娣ニ〗档蚳s-CRP水平產(chǎn)生影響，與Hubacek等[13]研究結(jié)果類似。通常E4等位基因攜帶者血清TC、LDL-C水平較高，其患冠心病風(fēng)險增加[14]。hs-CRP高水平是冠心病的危險因素，然而本研究中的E4等位基因攜帶者hs-CRP水平較低，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，ApoE基因多態(tài)性會影響高脂血癥病人血清TC，LDL-C水平，從而影響瑞舒伐他汀的調(diào)脂療效，臨床上可以根據(jù)病人ApoE基因多態(tài)性來指導(dǎo)他汀類藥物治療方案。