血清外泌體中甲胎蛋白、高爾基體跨膜糖蛋白73、超氧化物歧化酶表達水平在肝癌診斷中的意義

李卓嫻,徐麗靜,溫小雨,孫玉浩,夏 猛 (廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西 南寧 530200)

肝癌屬世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，為全球范圍內與癌癥相關的主要死亡原因，位居癌癥死亡原因的第四位[2]。中國是肝癌的高發地區，據全球腫瘤流行病學統計數據顯示，2012年我國肝癌發病率占全球50%[3-4]?，F今對肝癌的治療主要賴于化療、介入治療、手術以及綜合治療等，雖手術切除或肝臟移植可根治肝癌，但由于肝癌發病隱匿，常無特異性癥狀，也無明顯陽性體征，而血清學檢測甲胎蛋白易出現假陽性結果，準確率還有待提高[5]，且大部分肝癌患者一經診斷，多為中晚期，錯過手術根治的機會。為此尋求更加有效的肝癌早期診斷方法極其必要。外泌體(exosome)是一種從細胞內向胞外分泌的擁有典型脂質雙分子層膜結構的囊泡類小體[6]，攜帶著母細胞中多種蛋白質、脂類、DNA、RNA等重要信息并進行傳遞，存在于血漿、血清、羊水等多種生物體液中[7]。部分研究者發現，外泌體可參與、推動肝癌的發生發展，基于這些觀察，近年來多有研究者探索外泌體功能，并試圖以外泌體作為新型生物標志物，作為診斷或預后標志，尤以腫瘤領域較多[8]。甲胎蛋白(AFP)是一種糖蛋白，為現今診斷原發性肝癌特異性臨床指標[9]。高爾基體跨膜糖蛋白73(GP73)是肝癌早期診斷、術后評估復發病情的理想血清標志物[10]。而超氧化物歧化酶(SOD)又名肝蛋白，是一類可催化自由基如超氧陰離子進而發生歧化反應的金屬酶，通常SOD水平下降意味著衰老及死亡[11-12]。有學者研究表明，對肝癌血清標本進行生化檢測，以AFP、GP73、SOD三指標共同聯用有助于提高肝癌的診斷率[13]，但外泌體中相關指標是否與血液中的表達同步仍不明確，有待進一步研究。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年9月～2019年9月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院以及廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院住院治療的60例原發性肝癌患者為肝癌組，60名同期健康體檢者為對照組。肝癌組男38例，女22例，平均(55±6.1)歲；血清中AFP水平(671.1±87.8)ng/ml。對照組男39例，女21例；平均(52.5±8.3)歲；血清中AFP水平(8.4±0.9)ng/ml。對照組應排除其他疾病，肝癌患者均以穿刺活檢或病理組織檢查確診。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑：HT7800透射電鏡(日本電子公司)；50135643超速離心機(Thermo Fisher公司)；Exo Quick-TC外泌體提取試劑盒購自美國System Biosciences Inc公司；蛋白免疫印跡法(Western印跡)測定蛋白標志物CD63、Alix，Pierce山羊抗兔IgG、Pierce山羊抗鼠IgG均購自美國Santa cruz 公司；1×PBS購自中國索萊寶公司；Bradford蛋白質濃度測定試劑盒、QuickBlock Western一抗稀釋液、QuickBlock Western二抗稀釋液購自中國碧云天公司。

1.2.2外周血中外泌體的分離以及鑒定：使用美國SBI公司提供的外泌體提取試劑盒，分別收集了肝癌組、對照組的血漿樣品，用以分離外周血外泌體，遵循試劑盒使用說明嚴格操作。以進一步通過Western印跡法檢測外泌體表面蛋白標志物Alix、CD63的表達，分析外泌體的分泌水平，以透射電子顯微鏡觀察外泌體形態。

1.2.3乙酰膽堿酯酶(AchE)實驗測定外泌體濃度：采用AchE法可對純化的外泌體進行定量[14-15]，以100 mM雙硫代硝基苯甲酸(DTNB)作顏色指示劑，其于4℃條件可保存兩周；1 ml 1×PBS中制備28.9 mg碘代硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide)作底物，于-20℃條件可保存1個月。將10 ml 1×PBS、200 μl底物、500 μl DTNB混合制備顯色劑。將50 μl的外泌體樣品添至96孔板中，使用AchE濃度從0.98～2 000 mU/ml制成標準曲線。將50 μl標準溶液添至單獨的孔中，再將200 μl顯色劑添入所有的孔中。等待20 min孵育，使用酶標儀在A450 nm波長測量AchE的吸光度值，依據標準曲線、樣品體積計算濃度。

1.3分析評估AFP、GP73、SOD的表達水平:使用電化學發光法、酶聯免疫吸附法等方法測定血漿、外泌體中AFP、GP73、SOD的表達水平。通過檢測外周血和外周血外泌體中AFP、GP73、SOD表達水平，分析外泌體中相關指標是否與血液中相關指標的表達同步。

1.4統計學處理:所有數據選取SPSS23.0統計軟件處理，計量資料組間比較使用獨立樣本的t檢驗驗證；計數資料組間比較使用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1外周血中外泌體的分離、鑒定:Western印跡法檢測外泌體標志蛋白Alix、CD63的表達水平見圖1；使用透射電鏡觀察外泌體形態，電鏡下可見提取的外泌體呈現圓形或橢圓形，大小不均，具備著明顯的膜性結構，見圖2。

圖1 外泌體標志蛋白Alix、CD63表達

2.2外泌體含量在肝癌患者外周血中增加：使用AchE法檢測外泌體濃度，并已通過Western Blot確認了外泌體的身份。經AchE測定肝癌組及對照組的血漿樣本中的外泌體濃度發現，肝癌組的外泌體濃度為(376.02±55.0)mU/ml，高于對照組的(184.4±17.1)mU/ml，外泌體的釋放量高，差異具有統計學意義(P<0.001)。見圖2A。Western Blot分析表明兩組外泌體樣本中的外泌體標志蛋白Alix、CD63的表達存在差異，肝癌組外泌體中Alix、CD63的表達高于對照組。見圖3。

圖2 電鏡下外泌體形態結構

圖3 兩組外泌體標志蛋白表達差異

2.3AFP、GP73、SOD在血漿、外泌體中的表達

2.3.1AFP在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中AFP在血漿、外泌體中的表達水平均低于肝癌組，差異有統計學意義(P<0.001)；肝癌組中，AFP在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 AFP 在血漿、外泌體中的表達水平差異

2.3.2GP73在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中GP73的表達水平均低于肝癌組，差異有統計學意義(P<0.001)；肝癌組中，GP73在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 GP73在血漿、外泌體中的表達水平差異

2.3.3SOD在血漿、外泌體中的表達水平差異:對照組中SOD的表達水平均高于肝癌組，差異有統計學意義(P<0.001)；肝癌組中，SOD在血漿中的表達水平高于其在外泌體中的表達水平，差異有統計學意義(P<0.001)。見表3。

表3 SOD在血漿、外泌體中的表達水平差異

3 討論

原發性肝癌(HCC)是一類多病因相關且廣泛流行的癌癥，為全球癌癥死亡的第四大原因[16]。肝癌的發病隱匿，早期常無特異性癥狀、陽性體征，通常在診斷時，約70%的患者已為晚期肝癌[17]，能夠根治肝癌治療方法是手術切除，但因大部分患者診斷肝癌時已為晚期，錯過了手術機會，尋求輔助肝癌早期診斷的手段及方法仍是當前亟待解決的關鍵問題。

目前臨床上多采用血清AFP作為診斷方法[18]，但其敏感性及特異性不高，容易被漏診誤診[19]，相關研究提示，AFP、GP73、SOD三者聯用的方法具有提高肝癌的診斷率的作用[19]。

AFP是一種糖蛋白，正常成年人血清中含量尚不到20 μg/L，當肝細胞發生癌變、病情惡化時，AFP在血清中的含量會急劇增加，因此AFP就成了診斷原發性肝癌的一個特異性臨床指標，可見在大約80%的肝癌患者血清中升高。但AFP對早期肝癌患者的陽性率僅為50%～60%[20]，且不易與肝炎、肝硬化等進行區分，大程度限制了肝癌的早期診斷。檢索現有文獻發現，雖血清AFP可作肝癌診斷指標之一，但從外泌體中AFP含量變化探討外泌體中AFP在肝癌診斷和治療作用的研究尚未見報道，因此有必要進一步探討外泌體中AFP含量，以進一步明確外泌體在肝癌診斷和治療評價中的作用和意義。

GP73是新興出現的對肝癌早期診斷和術后復發病情評估的理想血清標記物[21-22]。GP73通常在肝細胞中幾乎不表達，但發生病變時若受病毒感染，其表達可顯著高于正常肝組織3～5倍。趙運勝等[23-24]研究發現，原發性肝癌患者血清GP73水平顯著高于肝硬化和正常對照組，且其敏感性和特異性高于AFP。另有肝癌土撥鼠模型研究[25]發現，模型組GP73水平顯著高于正常對照組，說明GP73表達異常與肝癌有密切關系。更有相關研究[26]表明，GP73的敏感性、特異性遠高于40年前問世的AFP，可高達95%及74%，若聯合檢測將大幅提升肝癌診治水平。

SOD又名肝蛋白，是人體內重要的抗氧化活性物質，通常SOD水平下降意味著衰老及死亡。肝癌患者機體內存在大量具有超氧化作用的活性氧[26]。活性氧又被稱為機體垃圾，一旦過剩存在便會引起多種氧化應激反應，進而損傷細胞，甚至造成細胞死亡。在肝細胞中SOD的活性最高，SOD可以與氧自由基造成的損害相對抗，并將過剩的氧自由基及其衍生物消除使細胞免受傷害，進而發揮抑制腫瘤生成的作用。研究表明[13]肝癌組SOD水平顯著低于肝硬化組和對照組，且在原發性肝癌的診斷中，AUC為0.791，可見SOD水平檢測用于原發性肝癌診斷具有一定的可行性。

近年來，外泌體作為包括癌癥在內的不同疾病的新型生物標志物受到了越來越多的關注[27]。外泌體是一種由細胞向胞外分泌的囊泡類小體，可存在于多種生物體液中，可攜帶著多種蛋白質、DNA及RNA等重要信息在細胞-細胞間進行物質、信息的傳遞，同時外泌體存在于血液、汗液、尿液等體液中，取材相對簡單方便，使得外泌體可成為液體活檢的理想工具[28]。此外，外泌體在肝癌的發生、發展過程中有重要作用，而血清診斷指標AFP、GP73和SOD均有可作為外泌體診斷和治療評價的潛在指標，本研究在此基礎上進一步探討外泌體及其內涵的AFP、GP73和SOD等聯合檢測在肝癌診斷中的作用，對于開發肝癌新的診斷工作和方法具有重要意義。

本次研究通過對臨床病例采用觀察發現，提取的外泌體Alix、CD63表達顯著，且在電鏡下觀察到了外泌體的形態結構，確定該方法提取的外泌體可靠，且分析結果顯示肝癌組外泌體中AchE、Alix、CD63含量高于對照組，因此判定肝癌患者中外泌體釋放量高于對照組。經電化學發光法、酶聯免疫吸附法等檢驗發現，AFP、GP73在肝癌中的表達俱呈現上升趨勢，且在血漿中的表達均高于其在外泌體中的表達。SOD則在肝癌中呈現下降趨勢，其在血漿中的表達水平高于外泌體中的表達水平，AFP、GP73、SOD等三指標在血漿及外泌體中的趨勢均呈同步狀態。

外泌體作為新型的一種分子實體，能輔助肝癌的早期診斷，具有微創、敏感度高、特異性強等優勢，且具有更高的穩定性，隨著外泌體提取、檢測技術的發展，外泌體檢測將會具備更加良好的發展前景。此次研究表明，血清診斷指標AFP、GP73、SOD有望成為外泌體診斷肝癌及治療評價的潛在指標，外泌體診斷肝癌具備準確、快速、微創、高穩定性等優勢。