止咳化痰合劑對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥損傷的保護(hù)作用

謝軼群，鞠秋燕，周 翔，韓林華，王雪芹，王 婧（如皋市中醫(yī)院，江蘇 如皋 226500）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）由多種原因誘發(fā)肺部慢性異常炎癥反應(yīng)所致，受遺傳和環(huán)境因素影響。 COPD的特征是逐漸加重和不完全可逆的氣流阻塞[1-2]。目前，吸煙被認(rèn)為是COPD的重要誘因。長期的炎癥刺激可能會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞（例如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的浸潤，從而釋放多種炎癥細(xì)胞因子參與肺部炎癥反應(yīng)[3]。宿主防御可分為先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)反應(yīng)。先天免疫系統(tǒng)可以通過Toll樣受體與微生物中高度保守的分子相互作用而迅速做出反應(yīng)，例如：TLR-4識別革蘭陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）并與其表位結(jié)合后激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和促炎基因的表達(dá)[4-5]。同時，COPD 患者的TLR4和NF-κB（p65）蛋白異常激活[6]。

止咳化痰合劑為我院院內(nèi)制劑（ZKHT，蘇藥制字Z04001602），組方含陳皮、桔梗、前胡、白前、紫苑、法半夏、浙貝母、連翹、黃芩、苦杏仁、生甘草。主要功效為清肺、止咳、化痰。有研究[7]表明，在COPD患者的臨床治療中加用止咳化痰合劑，可優(yōu)化患者的治療效果，改善肺功能，減輕氣道炎癥反應(yīng)，提高氣道清除率。然而，關(guān)于止咳化痰合劑的具體的生物學(xué)機(jī)制尚未闡明，本研究通過構(gòu)建COPD大鼠模型，觀察其肺部病理學(xué)變化、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激改變情況，探索止咳化痰合劑對COPD大鼠炎癥損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為藥物的合理開發(fā)和利用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

依托南通大學(xué)，選用清潔級健康SD大鼠32只，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）20190001；動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0045。采用煙霧吸入加LPS灌肺復(fù)合因素建立COPD大鼠模型[8]。在造模的第1天、第14天對大鼠行1%戊巴比妥鈉2.4 mL·kg-1腹腔注射麻醉后，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導(dǎo)管行氣管插管，向大鼠氣管內(nèi)注入LPS 200 μg，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)5 ～ 10 s（旋轉(zhuǎn)速度：1 周·s-1），使LPS 均勻分布于肺部。第2 ～ 13天、第15 ～ 28 天，每日在有機(jī)玻璃密閉箱（80 cm×60 cm×50 cm，4 個側(cè)面均有一直徑為1 cm 的通氣孔）中持續(xù)吸入新鮮的香煙霧30 min，10支·d-1，造模28 d 結(jié)束。對照組僅在第1天和第14 天予氣管內(nèi)滴注等量的0.9%氯化鈉注射液，置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試藥

止咳化痰合劑為我院院內(nèi)制劑（ZKHT，蘇藥制字Z04001602）；LPS（Sigma公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；兔單抗TLR4和GAPDH（Abcam公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG Ⅱ抗（武漢賽維爾公司）。

1.3 給藥方法

將32只大鼠分為對照組、COPD組、COPD +ZKHT低劑量組、COPD + ZKHT高劑量組。未做任何處理的大鼠作為對照組，造模成功的大鼠隨機(jī)平均分為COPD組、COPD + ZKHT低劑量組、COPD +ZKHT高劑量組。對照組和COPD組大鼠正常飼養(yǎng)，每日灌服等量0.9%氯化鈉注射液。止咳化痰合劑成人每日用量為150 mL，大鼠（體質(zhì)量200 g）用量=0.018×成人用量（體質(zhì)量70 kg）。該方法計算結(jié)果為中劑量，其1/2 劑量為低劑量組，2 倍劑量為高劑量組。

1.4 肺組織學(xué)檢查

LPS給予24 h后注射水合氯醛處死大鼠，采用0.01 moL·L-1磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）灌注10 min，再灌注4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）15 min。 采集的肺組織用4% PFA固定24 h，石蠟包埋，切片成5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察。 通過在盲測中由兩名病理學(xué)家對組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行評分，對圖像進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估。觀察是否有水腫、充血和充血、中性粒細(xì)胞邊緣和組織浸潤、肺泡內(nèi)出血和碎片以及細(xì)胞增生現(xiàn)象并根據(jù)嚴(yán)重程度給予相應(yīng)評分：不存在（0分）、輕度（1分）、中度（2分）和重度（3分），并計算每只動物的總分[9]，評分越高說明組織損傷越嚴(yán)重。

1.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集和分析

在LPS攻擊后24 h注射水合氯醛處死大鼠。將 7號針插入尾靜脈并收集血液進(jìn)行測試[10]。將鈍性7號腰椎穿刺針插入氣道并用金屬絲固定，通過鈍性解剖分離大鼠氣管。滴注 5 倍體積的 5 mL 0.9%氯化鈉注射液，輕輕吸出、匯集并再次吸出。于4 ℃下以2990 r·min-1離心10 min，四組之間在肺灌洗過程后回收的BALF總體積沒有差異。收集上清液并于-80 ℃儲存。使用ELISA試劑盒根據(jù)說明書測定BALF中炎性因子TNF-α、IL-1β的水平。沉淀的細(xì)胞用0.01 moL·L-1PBS重懸，然后以2990 r·min-1離心10 min。將10 μL沉淀的細(xì)胞涂在載玻片上并通過吉姆薩染色。用光學(xué)顯微鏡拍攝圖像以觀察細(xì)胞類型和形狀。

1.6 氧化水平標(biāo)志物的活性測定

脂質(zhì)氧化水平的標(biāo)志物采用MDA活性測定法測定，抗氧化水平的標(biāo)志物采用SOD活性測定法測定。LPS 攻擊后 24 h，注射水合氯醛處死大鼠，收集右下葉肺樣本并在冷 PBS中勻漿。收集100 μg肺組織并立即予4 ℃下在1 mL PBS中勻漿，后以4400 r·min-1離心15 min。收集上清液用于檢測MDA和SOD水平。然后使用測定試劑盒測量SOD活性（U·mL-1）和MDA濃度（nmol·mg-1）。分別通過光譜法在532 nm和550 nm處測量MDA和SOD的吸光度。MDA和SOD的水平通過每個吸光度計算。

1.7 免疫組織熒光染色

在大鼠左肺的石蠟包埋切片（5 μm）依次脫蠟脫二甲苯，隨后加入TLR-4的一抗，并在4 ℃下孵育過夜。加入FITC標(biāo)簽的山羊抗兔二抗溶液反應(yīng)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。然后將切片用乙醇脫水，用中性樹膠密封，在顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白質(zhì)印跡檢測

將右肺組織切片加入裂解液裂解。將勻漿離心10 min，分離上清液，然后在562 nm波長下測量蛋白質(zhì)濃度。隨著SDS-PAGE凝膠的制備，每孔上樣10 μL蛋白質(zhì)。電泳后，將目標(biāo)蛋白范圍內(nèi)的凝膠切掉，移到NC膜上，用5%脫脂牛奶密封2 h。用 PBS-T緩沖液洗脫3次（每次3 min）后，加入TLR-4一抗并在4 ℃下孵育。后用 PBS-T洗脫3次（每次3 min），加入二抗孵育2 h，然后用另一輪PBS-T緩沖液洗脫3次（每次3 min）。ECL顯影后，使用凝膠成像儀進(jìn)行曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)檢查

組織病理學(xué)檢查顯示，對照組大鼠肺組織表現(xiàn)為較典型的正常結(jié)構(gòu)，肺泡壁薄，肺間質(zhì)和肺泡間隙無中性粒細(xì)胞浸潤，肺臟組織學(xué)評分（0.37±0.09）分。COPD造模成功的大鼠肺泡壁增厚、肺間質(zhì)和肺泡間隙中有中性粒細(xì)胞浸潤、實(shí)變和肺泡出血。COPD組肺臟組織學(xué)評分為（4.24±0.36）分，顯著高于對照組（P＜ 0.001），與COPD組相比，止咳化痰合劑治療減少了浸潤的炎癥細(xì)胞并顯著改善了肺結(jié)構(gòu)，且應(yīng)用止咳化痰合劑后肺組織評分顯著降低，高劑量組的組織學(xué)評分為（1.33±0.21）分，顯著優(yōu)于低劑量組[（2.81±0.25）分，P＜ 0.01]。

2.2 BALF分析

通過ELISA法分析BALF中的炎性因子IL-1β和TNF-α的水平，結(jié)果顯示，COPD組的BALF中，IL-1β和TNF-α水平顯著高于對照組，而應(yīng)用止咳化痰合劑后，上述炎性因子指標(biāo)均顯著回落，其中高劑量的療效優(yōu)于低劑量。隨后，采用Giemsa染色觀察BALF中炎癥細(xì)胞的類型和形狀。結(jié)果顯示，止咳化痰合劑治療顯著降低了COPD大鼠BALF中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的總數(shù)和類型。見表1。

表1 各組大鼠BALF 中IL-1β及TNF-α水平. n = 8，ng·mL-1Tab 1 IL-1β and TNF-α levels in BALF of rats in each group. n = 8, ng·mL-1

2.3 止咳化痰合劑的抗氧化作用

為了探索止咳化痰合劑對COPD大鼠肺保護(hù)作用的潛在機(jī)制，本研究測量了MDA和SOD水平。如表2所示，與對照組相比，COPD組MDA表達(dá)顯著升高，SOD表達(dá)顯著降低。與COPD組相比，止咳化痰合劑組SOD活性升高，MDA活性顯著降低，同時止咳化痰合劑COPD大鼠肺的抗氧化作用呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠肺SOD及MDA水平. n = 8Tab 2 Levels of SOD and MDA in lung of rats in each group. n = 8

2.4 肺組織TLR4蛋白表達(dá)

肺組織的免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗的結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織中TLR4的蛋白表達(dá)水平相對較低[（100.00±12.35）%]。與對照組相比，COPD組大鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)增加[（446.01±32.19）%，P＜ 0.001]，給予止咳化痰合劑后，與COPD組相比，低、高劑量組大鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)均顯著降低[（303.97±17.39）%vs（147.62±18.90）%]并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量組中TLR4蛋白表達(dá)顯著低于低劑量組（P＜ 0.05）。

3 討論

COPD是一種在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前普遍認(rèn)為吸煙等行為會誘發(fā)有害氣體或顆粒物引起的肺部異常炎癥反應(yīng)，是造成COPD的原因之一。本研究采用吸煙和脂多糖方法誘導(dǎo)COPD疾病動物模型，模型組大鼠肺部有顯著的病理損害（如炎癥浸潤和纖維化的發(fā)展），并顯著增加COPD大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的分泌，這與以往文獻(xiàn)[11]報道結(jié)果一致，提示大鼠COPD模型建立成功。

有研究[12]表明，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，用自由基清除劑預(yù)處理可有效減少BALF炎癥細(xì)胞因子的釋放，并減輕肺損傷的程度。本實(shí)驗以肺組織中MDA和SOD的含量作為反映氧化應(yīng)激和肺組織損傷程度的指標(biāo)。MDA是由細(xì)胞膜和線粒體膜發(fā)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，直接反映了體內(nèi)活性氧的活性和數(shù)量，間接反映了細(xì)胞損傷的程度。SOD是一種重要的抗氧化酶，能消除超氧陰離子，減少原型亞硝酸鹽形式造成的損傷，對肺有保護(hù)作用。SOD的表達(dá)水平與肺損傷程度呈顯著負(fù)相關(guān)，而氧化應(yīng)激的產(chǎn)物會降低SOD的活性[13]。與其他炎性疾病類似，COPD的特征是炎癥細(xì)胞因子在氣道中的積累和激活，這些細(xì)胞因子對誘導(dǎo)炎癥至關(guān)重要，包括TNF-α、IL-1β。本研究結(jié)果顯示，止咳化痰合劑顯著下調(diào)了炎癥細(xì)胞因子和TLR-4蛋白表達(dá)，說明止咳化痰合劑能有效抑制COPD引起的炎癥介質(zhì)的釋放，可以通過抑制TLR4信號通路來干預(yù)COPD的反應(yīng)，從而改善肺的病理損傷。

綜上所述，止咳化痰合劑可減輕肺組織充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤癥狀，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，改善肺病理損害，同時抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)，下調(diào)TLR-4蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果為止咳化痰合劑應(yīng)用于臨床中治療COPD提供了實(shí)驗數(shù)據(jù)。