黃連素通過下調miR-1224-3p緩解過氧化氫誘導的胰島β細胞損傷研究

孫 超，郭獻山，張 瑩，吳蘇豫，熊承云（新鄉市中心醫院內分泌科，河南 新鄉 453000）

糖尿病的發病率逐年增長，其發生發展與胰島β細胞功能障礙和凋亡密切相關[1-2]，抑制或減輕胰島β細胞損傷對糖尿病的治療尤為重要。黃連素，亦稱小檗堿，是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，具有多種藥理活性[3]。有報道[4]稱其可能通過上調胰腺組織中Pdx-1蛋白表達，顯著降低2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，改善胰腺組織病理性損傷。miR-1224-3p屬于微小RNA（microRNA，miRNA），參與調控細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激，與多種疾病的發生發展密切相關。有報道稱，miR-1224-3p在1型糖尿病腎病患者尿液中表達升高[5]，但其對胰島β細胞損傷的影響還未知。本研究以小鼠胰島β細胞MIN6為研究對象，探究黃連素和miR-1224-3p對過氧化氫（H2O2）誘導的MIN6細胞凋亡及炎性因子表達的影響及黃連素能否調控miR-1224-3p來影響MIN6細胞凋亡及炎性因子表達，為日后將黃連素用于臨床治療糖尿病提供藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠胰島β細胞MIN6（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；DMEM培養基、Annexin V-FITC/PI試劑盒、CCK-8試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（均購自北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司）；miR-1224-3p抑制劑（anti-miR-1224-3p）、抑制劑陰性對照序列（antimiR-NC）、miR-1224-3p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）及引物序列（均購自上海生工生物工程有限公司）；IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鼠抗人Bcl-2和Bax抗體（美國Santa Cruz公司）；miRNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。QP-50 CO2培養箱（山東濟南鑫貝西生物技術有限公司）；ELX800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；CytoFLEX S流式細胞儀[貝克曼庫爾特（中國）有限公司]；GelDoc 2000凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；GeneAmp970型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 MIN6細胞培養和轉染 用含10% FBS的DMEM培養基培養MIN6細胞。接種MIN6細胞至6孔板中（5.0×105個·孔-1），用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉染anti-miR-1224-3p、anti-miR-NC、miR-1224-3p mimics、miR-NC。轉染12 h后，更換培養基。再培養24 h，采用RT-qPCR法檢測細胞中miR-1224-3p表達對轉染效果進行驗證，用于后續實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 將未轉染、轉染后的MIN6細胞均接種于96孔板中（5.0×104個·孔-1），常規培養基培養4 h后，棄培養基，分組處理。未轉染的MIN6細胞分為對照組（常規培養基培養26 h）、模型組（先用常規培養基培養24 h，然后再同含0.1 mmol·L-1H2O2的培養基作用2 h[6]）和低、中、高劑量黃連素組（先用含1.0、2.5、5.0 μmol·L-1黃連素的培養基干預24 h，然后再用含0.1 mmol·L-1H2O2的培養基共同作用2 h[7]）。轉染anti-miR-1224-3p、anti-miR-NC的細胞處理同模型組，分別記為anti-miR-1224-3p組、anti-miR-NC組。轉染miR-1224-3p mimics、miR-NC的細胞處理同高劑量黃連素組，記為高劑量黃連素+miR-1224-3p組、高劑量黃連素+ miR-NC組。各組細胞處理結束后，加CCK-8（10 μL·孔-1），孵育2 h。置于酶標儀卡槽中，設置檢測波長450 nm，測定各孔光密度（optical density，OD）。增殖抑制率（%）=（1 -OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 接種細胞至6孔板中（5.0×105個·孔-1），按照“1.2.2”項進行分組和處理。各組培養結束后，收集細胞，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.4 蛋白印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 接種細胞至6孔板中（5.0×105個·孔-1），按照“1.2.2”項進行分組和處理。各組培養結束后，收集細胞，用RIPA試劑提取細胞中的總蛋白，經BCA法檢測蛋白含量后，行10% SDS-PAGE電泳。將分離蛋白轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別置于Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）一抗孵育液中，置于4 ℃冰箱過夜。再于山羊抗兔二抗（1∶2000）孵育液中，37 ℃搖床孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，使用Image J軟件分析Bax和Bcl-2相對于GAPDH的表達量。

1.2.5 ELISA法檢測細胞培養上清液中炎性因子水平 接種細胞至6孔板中（5.0×105個·孔-1），按照“1.2.2”項進行分組和處理，收集細胞培養上清液，以3500 r·min-1離心10 min。取上清液，利用IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒，采用ELISA法檢測其水平。

1.2.6 RT-qPCR檢測細胞中miR-1224-3p表達 采用miRNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：miR-1224-3p上游5'-CCCCACCTCCTCTCTCCTCAG-3'，下游5'-GCAGATCGGCTGAGTCGATCG-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。計算miR-1224-3p相對U6的表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件分析實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。以P ＜ 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MIN6細胞的增殖和凋亡

與對照組比較，模型組MIN6細胞抑制率、凋亡率、細胞中Bax蛋白表達升高（P ＜ 0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P ＜ 0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量黃連素組MIN6細胞抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達均降低（P ＜ 0.05），Bcl-2蛋白表達升高（P ＜ 0.05），見表1。

表1 黃連素對H2O2處理的MIN6細胞增殖和凋亡的影響Tab 1 Effect of berberine on the proliferation and apoptosis of MIN6 cells treated with H2O2

2.2 炎性因子

模型組MIN6細胞培養上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著高于對照組（P＜ 0.05）；低、中、高劑量黃連素組MIN6細胞培養上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著低于模型組（P＜ 0.05），見表2。

表2 黃連素對H2O2處理的MIN6細胞培養上清液中炎性因子表達的影響. pg·mL-1Tab 2 Effect of berberine on the expression of inflammatory factors in the culture supernatant of MIN6 cells treated with H2O2. pg·mL-1

2.3 黃連素對H2O2處理的MIN6細胞中miR-1224-3p的影響

模型組MIN6細胞中miR-1224-3p表達高于對照組[（3.16±0.24）vs（1.01±0.04），P＜ 0.05]；低、中、高劑量黃連素組MIN6細胞中miR-1224-3p表達分別為（2.83±0.15）、（2.14±0.12）、（1.51±0.09），均低于模型組，P＜ 0.05。

2.4 下調miR-1224-3p對H2O2處理的MIN6細胞增殖和凋亡的影響

轉染anti-miR-1224-3p的MIN6細胞中miR-1224-3p表達量低于轉染anti-miR-NC的細胞[（0.43±0.03）vs（1.02±0.07），t= 8.298，P＜ 0.05]。與轉染anti-miRNC的細胞比較，轉染anti-miR-1224-3p的MIN6細胞經H2O2處理后，細胞抑制率、凋亡率及Bax蛋白表達均降低。見表3。

表3 下調miR-1224-3p對H2O2處理的MIN6細胞凋亡的影響Tab 3 Effects of miR-1224-3p downregulation on apoptosis in MIN6 cells treated with H2O2

2.5 下調miR-1224-3p對H2O2處理的MIN6細胞培養上清液中炎性因子表達的影響

與轉染anti-miR-NC的細胞比較，轉染anti-miR-1224-3p的MIN6細胞經H2O2處理后，細胞培養上清液中炎性因子水平均顯著降低。見表4。

表4 下調miR-1224-3p對H2O2處理的MIN6細胞培養上清液中炎性因子表達的影響Tab 4 Effect of downregulation of miR-1224-3p on the expression of inflammatory factors in the supernatant of MIN6 cells treated with H2O2

2.6 上調miR-1224-3p逆轉黃連素對H2O2處理的MIN6細胞凋亡的影響

轉染miR-1224-3p mimics的MIN6細胞中miR-1224-3p表達高于轉染染miR-NC的MIN6細胞[（2.12±0.13）vs（1.01±0.05），t= 8.085，P＜ 0.05]。與轉染miR-NC的MIN6細胞比較，轉染miR-1224-3p mimics的MIN6細胞經5 μmol·L-1黃連素和H2O2干預后，細胞抑制率、凋亡率及Bax蛋白表達均升高。見表5。

表5 上調miR-1224-3p逆轉黃連素對H2O2處理的MIN6細胞凋亡的影響Tab 5 Effect of upregulation of miR-1224-3p reversed the effect of berberine on apoptosis in MIN6 cells treated with H2O2

2.7 上調miR-1224-3p逆轉黃連素對H2O2處理的MIN6細胞中炎性因子表達的影響

與轉染miR-NC的MIN6細胞比較，轉染miR-1224-3p mimics的MIN6細胞經5 μmol·L-1黃連素和H2O2干預后，細胞培養上清液中炎性因子的表達均升高[IL-6：（183.73±8.57）pg·mL-1vs（102.28±4.32）pg·mL-1，t= 8.484，P＜ 0.05；IL-1β：（169.37±5.44）pg·mL-1vs（86.19±5.20）pg·mL-1，t= 11.063，P＜ 0.05；TNF-α：（196.34±10.65）pg·mL-1vs（95.58±5.35）pg·mL-1，t= 8.457，P＜ 0.05]。見表6。

表6 上調miR-1224-3p逆轉黃連素對H2O2處理的MIN6細胞培養上清液中炎性因子表達的影響Tab 6 Upregulation of miR-1224-3p reversed the effect of berberine on inflammatory factors expression in the culture supernatant of MIN6 cells treated with H2O2

3 討論

黃連素作為黃連的主要有效成分，毒副作用較小，具有降血糖、降血脂及改善胰島素抵抗等多種藥理活性，對糖尿病及其并發癥具有明顯的治療效果。研究顯示，黃連素可通過抑制腎AGEs-RAGE通路活性明顯降低糖尿病腎病大鼠血糖并改善腎功能[8]；黃連素可通過激活PI3K/Akt通路改善糖尿病大鼠腎功能損害情況且減輕足細胞功能障礙，具有治療糖尿病腎病的潛在價值[9]。本研究顯示，H2O2可促進胰島β細胞凋亡，說明H2O2誘導的胰島β細胞損傷模型建立成功；而黃連素可呈劑量依賴性降低H2O2誘導的胰島β細胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax表達，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，提示其能通過調控Bax/Bcl-2蛋白減少H2O2誘導的胰島β細胞凋亡，發揮保護作用。促炎性細胞因子可引起胰島β細胞功能缺陷和凋亡[10]。有報道[11]稱，黃連素可能通過調控血清IL-6、IL-10和CRP降低2型糖尿病大鼠血糖和血脂。本研究顯示，黃連素預處理可降低H2O2誘導的胰島β細胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α，提示其可減輕炎性損傷。

miRNA參與調節細胞增殖、分化和凋亡等生命活動，在糖尿病的發生發展中起重要調控作用[12]。研究已表明，miR-203a、miR-18等多種miRNA參與調控胰島β細胞功能[13-14]。本研究顯示，下調miR-1224-3p可抑制H2O2誘導的胰島β細胞凋亡及炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達，提示miR-1224-3p可作為減輕胰島β細胞損傷的分子靶點。本研究還顯示，黃連素可有效抑制miR-1224-3p的表達，而上調miR-1224-3p逆轉黃連素對H2O2誘導的MIN6細胞凋亡及炎性因子表達的抑制作用，提示黃連素可能通過下調miR-1224-3p來減輕H2O2誘導的胰島β細胞損傷。但miRNA通過靶向基因的表達發揮調控作用，因此推測黃連素可能通過靶向下調miR-1224-3p進而影響miR-1224-3p靶基因的表達來調控胰島β細胞凋亡和炎癥因子的表達，但其具體作用的miR-1224-3p靶基因有待深入探究。

綜上，黃連素可呈劑量依賴性減少H2O2誘導的胰島β細胞凋亡及炎性因子表達，對胰島β細胞損傷發揮保護作用，其作用機制可能與下調miR-1224-3p表達有關，但仍有待更多研究來證實。