氣相色譜法測定石杉堿甲合成中間體基因毒性雜質苯硫酚

陳安，孫利榮，趙云超，李娟

萬邦德制藥集團有限公司，浙江 溫嶺 317500

石杉堿甲（huperzine A）是從石杉科植物千層塔中分離得到的一種天然生物堿，是一種具有高特異性且可逆的乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑［1-2］。石杉堿甲在動物模型中表現出能夠減弱或者逆轉認知損害［3-4］，在臨床上也已經被證明能顯著改善衰老性健忘老年人和老年癡呆或血管性癡呆患者的記憶缺陷，不良反應發生率低，有較好的臨床安全性［5-6］。1996 年，石杉堿甲在國內按二類新藥批準其用于阿爾茨海默病（AD）的治療［7］。

石杉堿甲易透過血腦屏障、作用時間長、口服利用度高，被許多醫院廣泛應用于AD 的治療［8-9］，而通過植物提取所得到的石杉堿甲得率低，極大限制了其臨床應用，通過人工合成的方法能夠實現石杉堿甲產業化［10］。1989 年，A.P.Kozikowski 課題組［11-12］實現了石杉堿甲的全合成，之后，嵇汝運院士所在課題組［13］對石杉堿甲合成工作做了總結。在合成石杉堿甲中間體過程中使用了苯硫酚鈉而產生了苯硫酚，苯硫酚具有較高毒性，危害中樞神經系統，導致肌肉萎縮、呼吸困難、昏迷等癥狀［14-16］，因而建立一種苯硫酚的檢測方法非常重要。目前，未見有基因毒性苯硫酚質量控制的氣相色譜方法報道。為有效控制石杉堿甲的質量和用藥安全，本實驗采用氣相色譜法對苯硫酚進行考察，并進行方法學驗證，為石杉堿甲合成中間體的質量標準提供數據支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B 型氣相色譜儀（美國Agilent 公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

苯硫酚（分析純，純度99.0%，批號：11872，山東西亞化學工業有限公司）；乙酸（分析純，批號：20190810，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；乙腈（色譜純，批號：0114210101，上海星可高純溶劑有限公司）；石杉堿甲合成中間體（LE-11，甲基（5R，9R，E）-11-亞乙基-2-甲氧基-7-甲基 -9,10-二氫-5,9-甲基環辛基［b］吡啶-5（6H）-羧酸鹽，CAS：185741-44-0，批號：QSSJJ11191001，萬邦德制藥集團有限公司提供）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：島津Inert Cap 5 毛細管柱（30 m×0.53 mm×1.5 μm）；升溫程序：起始柱溫為40 ℃，維持10 min，以10 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，以30 ℃/min的速率升溫至280℃，維持19 min；進樣口溫度為220 ℃；檢測器為FID，檢測器溫度為280 ℃；空氣流量為300 mL/min；氫氣流量為30 mL/min；尾吹氣25 mL/min；載氣為氮氣，流量為4.0 mL/min；分流比為5∶1；進樣量：1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液 以乙腈:乙酸（97∶3，v/v）為空白溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取苯硫酚101.22 mg，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備溶液1；精密移取10 mL 對照品儲備溶液1，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備溶液2；精密移取10mL對照品儲備溶液2，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。

2.2.3 加標供試品溶液 精密稱取1.0 g 的LE-11，置于10 mL 量瓶中，精密移入1.0 mL 對照品儲備溶液2，加空白溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得加標供試品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 取“2.2”項下配制的空白溶液、對照品溶液和加標供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，色譜圖見圖1。結果顯示，空白溶液無干擾峰，加標供試品溶液中中苯硫酚與供試品自帶的雜質峰之間分離度為4.96，理論塔板數和拖尾因子均符合要求，表明專屬性良好。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下的對照品儲備溶液2 各1.5、3.0、5.0、7.5、10.0 mL，分別置于50 mL 量瓶中，加入空白溶液稀釋至刻度，搖勻。分別精密移取上述系列溶液置于進樣瓶中，加蓋密封。按照“2.1”項下色譜條件進行分析測定，以質量濃度X為橫坐標（μg/mL）、峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程為Y=2.816 4X-1.770 5，相關系數r=0.999 7，結果表明苯硫酚在3.006 2～20.041 6 μg/mL 的質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度考察 精密量取對照品溶液置于進樣瓶中，密封搖勻，平行配制6 份，按“2.1”項下色譜條件分析測定，計算得到苯硫酚峰面積的相對標準偏差（RSD）為1.79%（n=6），表明精密度良好。

2.3.4 檢測限和定量限 取“2.2”項下的對照品溶液，并逐級稀釋成一定濃度，分別進樣，以信噪比為3 時（S/N=3）的濃度作為最低檢測限度（LOD），以信噪比為10 時（S/N=10）作為定量檢測限濃度（LOQ），結果：苯硫酚檢測限為0.995 5 μg/mL，定量限為2.986 6 μg/mL。

2.3.5 加樣回收率試驗 取LE-11 供試品各約1.0 g（共9 份），精密稱定，分別置于10 mL 量瓶中，精密移取對照品儲備溶液2 各0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL 量瓶中，配制低、中、高3 種質量濃度的對照品溶液，每個濃度溶液配制3 份，加入空白溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖1），計算回收率。回收率結果見表1，表明殘留溶劑回收率滿足要求。

表1 苯硫酚回收率實驗結果

2.3.6 耐用性試驗 取“2.2”項下的對照品溶液和加標供試品溶液各1 μL（因為純供試品中苯硫酚的量很少，不能很好地考察苯硫酚在供試品中的分離度，所以采用供試品加標的方式進行考察苯硫酚在供試品中的分離度），進樣分析，微小改變“2.1”項下色譜條件，測定，記錄色譜圖（見圖1），計算得出理論塔板數、拖尾因子、分離度。結果見表2，表明初始溫度變化±2 ℃、載氣流速變化±0.2 mL/min、更換不同批號的色譜柱、初始保留時間±1min，以及升溫速率±2 ℃/min 條件下，方法的耐用性良好。

表2 耐用性試驗結果

圖1 氣相色譜圖：A.空白溶液；B.對照品溶液；C.加標供試品溶液

2.3.7 穩定性試驗 對照品溶液和加標供試品溶液現配現用，置于進樣瓶中，密封搖勻，依次于0、3、6、9、12、18、24、36、48 h 進樣分析，記錄色譜圖，以各時間點苯硫酚峰面積與0 h 苯硫酚峰面積的比值作為衡量溶液是否穩定的標準（80%～120%）。結果見表3，說明對照品溶液在48 h 內穩定性良好，加標供試品溶液在12 h 內穩定。

表3 穩定性試驗結果

2.3.8 含量測定 分別精密稱取1.0 g LE-11，置于10 mL 量瓶中，使用空白溶液超聲溶解，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果供試品溶液中的苯硫酚含量為0.001%。

3 討論與結論

氣相色譜法的進樣方式有頂空進樣法和直接進樣法，低沸點溶劑適合頂空進樣，高沸點溶劑適合直接進樣［17-18］。在試驗中發現，苯硫酚在頂空進樣時發現無響應，直接進樣能很好出峰，故最終選擇直接進樣的方式。

苯硫酚不溶于水，易溶于有機溶劑，且針對石杉堿甲中間體LE-11 的溶解性，開始選擇乙腈∶乙酸乙酯作為空白溶液進行試驗，發現在對照品溶液中苯硫酚比較穩定，但是當苯硫酚加入到供試品溶液3 h后苯硫酚變得不穩定，由于苯硫酚在弱酸性的環境下，它會形成自由基，而這些自由基可能會跟樣品中的不飽和烴加成，最終使苯硫酚降解，故我們選擇在溶液中加入一定量的酸，使我們的溶液變成酸性，讓苯硫酚不那么容易形成自由基；經過試驗調整最終選擇乙腈∶乙酸=97∶3（v/v）作為空白溶液。

由于選擇了直接進樣的方式，樣品的主成分也會有出峰的可能，且其沸點較高，選擇弱極性的色譜柱可以快速有效的分析，所以本試驗選擇島津Inert Cap 5 作為色譜柱，該色譜柱獨特的內壁表面去活技術徹底清除了殘余在管內表面的鹵代化合物、硅烷醇基團和金屬粒子，保障了在快速分析的同時能有一個較好的峰型。

通過對專屬性、儀器精密度、檢測限和定量限、加樣回收率、穩定性、耐用性等方法學考察，說明本方法能夠對基因毒性雜質苯硫酚進行較好的質量控制。