基因多態性對宜昌地區類風濕關節炎患者甲氨蝶呤療效的影響*

李娜，閆喜明，陳進兵，金桂蘭，2

(1.三峽大學人民醫院·湖北省宜昌市第一人民醫院藥學部，宜昌 443000；2.三峽大學藥物制劑研究所，宜昌 443000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關節炎為主的自身免疫性疾病[1]，我國發病率為0.42%，總患病人群約500萬例[2]。隨著病情發展有致殘風險，將嚴重影響患者的日常生活。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是國內外一致推薦用于治療RA的最廣泛的緩解疾病的葉酸還原酶抑制藥。由于個體差異的存在，僅45%～65%患者對MTX治療有效，約30%患者因MTX治療不佳或毒副作用而停藥[3-4]。MTX的藥動學顯示，MTX的療效通常需要在服藥約6個月，藥物血藥濃度達穩定時才能進行預測[5]，在依據血藥濃度評估MTX療效這段時間內，患者病情可能在沒有控制的情況下造成不可挽回的影響。在臨床治療過程中，RA患者在開始給予MTX治療約3個月時就應根據病情進展，修改治療方案以期達到早期的癥狀緩解[6]，因此，可能預測MTX的療效是至關重要的。隨著單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)的研究，約有105個SNPs分子標記被用于基因功能及疾病相關研究，有助于解釋不同群體和個體對疾病的易感性及對各類藥物的敏感性[7]。近年來有風濕病治療藥物的基因組學研究，但大部分為國外人群的研究，在地方人群中的基因表達及藥物療效情況等報道很少。本次對MTX藥物相關的3個SNPs位點進行研究，試圖分析MTHFR C677T、MTHFR A1298C、ABCB1 C3435T基因多態性與RA患者對MTX藥物敏感性或耐受性的潛在聯系，為今后臨床個體化合理用藥提供新途徑。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2016年1月—2019年6月宜昌某三甲醫院藥學部基因檢測室進行過基因多態性檢測并出具檢測報告的住院患者病例資料。納入標準：①符合1987年美國風濕病協會(ACR)發布的RA分類標準或2010年ACR/歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)發布的RA分類標準做出RA診斷的患者；②同時檢測有MTHFR C677T、MTHFR A1298C、ABCB1 C3435T基因多態性有具體檢測報告的患者；③治療方案中已經使用或可能將使用MTX的患者；④研究經本院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：①排除使用MTX禁忌癥患者；②排除有嚴重骨髓抑制或嚴重肝功能損害的患者；③無知情同意書患者。依據患者的基因型分組：A組基因突變組(3個位點中至少有一個發生突變)，B組非突變純合組。

1.2研究方法 使用一次性 乙二酸四醋酸二鈉(EDTA) 抗凝血管，抽取患者靜脈血2～3 mL進行預處理后，使用熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司，型號：TL998A)，通過微測序基因分析技術即逆向雙脫氧測序，在實時熒光定量 PCR 儀上，實現對目標SNP位點的直接測序和判讀，測定患者MTHFR、ABCB1 基因C677T、A1298C、C3435T的單核苷酸的基因型。

利用醫院病例系統，收集整理入選患者基本信息：姓名、年齡、住院時間、診斷；用藥基本情況：治療用藥MTX用藥劑量、頻次、療程。RA的治療目標是達到疾病緩解或低疾病活動度即達標治療[1]，其標準[1]為28個關節疾病活動度(DAS28)≤3.2或臨床疾病活動指數(CDAI)≤10或簡化疾病活動指數(SDAI)≤11。由于不同病例記錄不盡相同，達標治療指數不能達到統一，僅能根據病例記錄初步判斷有效與無效。同時收集相關實驗室指標來進行研究，收集患者使用MTX 后0，3個月實驗室指標：紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應蛋白(CRP)、抗環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)等評價治療效果。

2 結果

2.1納入患者的基本臨床資料 符合標準的病例共64例，男14例，女50例，平均年齡(52.48±11.25)歲，平均體質量(59.69±9.46)kg，MTX給藥劑量為每周7.5～15 mg。

2.2宜昌地區RA患者基因分布情況 對64例RA患者的MTHFR C677T、MTHFR A1298C、ABCB1 C3435T基因型頻率統計后并進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，以判斷研究患者的基因型是否具有群體代表性，并計算各等位基因頻率，見表1。由表1可以看出，宜昌地區RA患者MTHFR C677T、MTHFR A1298C、ABCB1 C3435T基因型頻率和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律[8]，說明本組研究對象在理想狀態下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中是穩定不變的，可以代表該地區群體。

2.3基因多態性與藥物療效的相關分析

2.3.1患者基因分型與藥物療效比較 對64例患者進行回顧性分析，其中有效緩解45例， 11例患者治療效果不明顯(使用MTX3個月后停藥或加用其他藥物)，另有8例患者后期無復診隨訪記錄無法判定其治療效果。對56例患者基因分型與療效進行Sperman秩相關檢驗比較療效差異，相關系數的雙側檢驗P值均>0.05，表明基因分型與藥物療效不存在相關性。見表2。

2.3.2基因多態性與關節炎實驗室相關指標比較 按照三個等位基因分型理論組合有27種，實際檢測出14種組合型，其中基因突變組(A組)有13種組合型，共有51例，突變率為79.69%；非突變純合型組(B組)共13例，發生率為20.31%，試分析RA患者基因是否發生突變對ESR、CRP、CCP、ALT的影響，見表3。兩組患者一般資料比較性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)；服用MTX前后CRP數值改變差異有統計學意義(P<0.05)；基因突變組與非突變純合組對RA患者使用MTX后的ESR、ALT的數值改變比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 基因分型與治療效果相關性

2.3.3基因多態性與藥物安全性 在治療過程中有7例出現MTX相關不良反應，不良反應發生率為10.94%。1例轉氨酶升高(基因型CT+AA+CC)、1例貧血伴血小板下降(基因型CT+AA+TT)、1例口腔出血并牙齦增生(基因型CT+AA+TT)、3例白細胞降低并粒細胞減少(基因型CT+AC+CC/CT+AA+CT)，1例肝功能異常及發熱感染(基因型CT+AA+CT)均經治療得到緩解。

3 討論

MTX是一種葉酸類似物，其結構與葉酸十分相似，主要抑制二氫葉酸還原酶，阻止四氫葉酸的生成，導致DNA生物合成受阻，起到細胞毒性作用。MTX因其療效確切、價格低廉成為治療RA的錨定藥物[9]。但是MTX在臨床使用中具有顯著的個體差異，在治療過程中可導致多種不良反應發生，常見如骨髓抑制、肝腎損傷、口腔潰瘍等，排除諸多影響因素后，發現藥物個體化差異與個體基因多態性相關[10-11]。參與MTX體內轉運和代謝的轉運體及代謝酶很多，MTHFR是影響DNA合成、活化、修復和甲基化的一個關鍵調節酶，其多態性可能與MTX的療效和副作用相關，研究較多SNPs是C677T和A1298C兩個位點。ABC 轉運蛋白家族是一大類跨膜蛋白，ABCB1參與MTX 的藥物外排，其多態性可能與MTX的耐藥有關。目前，大量研究[12-15]表明MTHFR 677TT患者與MTX的血液毒性及肝毒性相關性，攜帶多藥耐藥基因ABCB1的患者肝毒性風險增高。但受不同地區不同人群的基因多態性影響，各研究結論不盡相同。并且大部分研究對象為國外人群，研究主題多為大劑量MTX所致毒副作用，以中國RA患者人群為樣本的使用小劑量MTX與MTHFR、ABCB1的SNPs研究較少。所以本研究對64例RA患者MTX藥物相關基因檢測結果及病例資料進行回顧性分析，根據指南中顯示[1]，關節疼痛、腫脹數量、ESR、CRP、ACPA等實驗室指標均為關節損害進展的預測因素。但在實際臨床資料收集過程中由于病例信息收集周期較長，部分病例前后關節疼痛、腫脹數量記錄內容沒有進行統一，有的后期沒進行量化評價，不能完成數據收集；并且病區醫生流動，管床醫生不固定，對關節疼痛、腫脹數量的量化評估存在主觀判定差異，前后不能進行對比。所以本研究選用患者病例資料ESR、CRP、CCP的數值來推斷MTX治療效果，以ALT的數值來預測MTX藥物副作用，以期進一步探究SNPs與MTX的個體化用藥之間的相關聯系，協助醫生確定最佳治療方案。本研究顯示，同類疾病患者間基因多態性存在個體化分布，發生基因突變患者(51例)明顯多于非突變純合患者(13例)，兩者在性別、年齡上差異無統計學意義。不同基因分型與療效無明顯相關性，但基因突變與否在ESR、ALT的數值變化有顯著性差異，由此可以預測基因型的改變是能影響藥物療效與不良反應的，這與文獻[16-19]報道結果相一致。

表3 基因多態性與關節炎實驗室相關指標比較

國內外對于MTX藥物基因相關多態性存在大量的研究，最主流的研究為急性淋巴細胞白血病治療過程中大劑量甲氨蝶呤(HDMTX)相關基因多態性，其中關于類風濕領域下MTX藥物基因多態性研究也大多主要集中在國外，如葡萄牙、西班牙、波蘭、塞爾維亞、荷蘭、印度、巴基斯坦、日本等，國內也有部分報道，但湖北省地市區無相關研究，由于不同區域人群之間可能存在差異，故本研究擬對本地人群進行相關性研究，為個體化用藥及精準醫療提供方向。本研究選取的宜昌某三甲醫院是宜昌地區最早開展藥物基因檢測單位，收集病例中包含宜昌市區及周邊縣市區的患者，具有一定地區代表性。

通過回顧性分析進行收集整理病例數據時可能由于病例記載造成一定的偏差。同時，由于基因檢測的認知度及費用較高等，致使本研究的病例數較少，進而可能造成藥物療效與MTHFR、ABCB1基因多態性未觀察到明顯相關性。基因多態性與藥物安全性的相關性研究由于樣本量太小，數據不足，需要增大樣本量后進行研究，以期評估宜昌地區RA患者的疾病預后，以提高其用藥安全。將基因檢測方法用于實際臨床治療，對用藥風險進行評估，具有較好的臨床意義，可以提高療效，減少嚴重不良反應的發生。臨床用藥前進行相關藥物基因檢測有助于藥物個體化管理實施，是醫院藥學的一個發展方向，是臨床藥師參與臨床診療的一個切入點，也為RA的個性化治療提供支持。