基于TLR4介導的信號通路探討人參皂苷Rg1抗腦缺血再灌注損傷的作用

馬雪飛 馮冬軍 于文霞 譚明 劉躍 翟鳳國

腦卒中（Cerebral stroke）是一種急性腦血管疾病。據推算，我國腦卒中患者約為1 300萬，而缺血性腦卒中占腦卒中人數的70%以上[1，2]。靜脈化學溶栓是目前治療缺血性腦卒中的主要治療手段之一，然而，通過溶栓治療恢復血流量會損害腦組織，造成腦缺血再灌注（I/R）損傷。目前腦I/R損傷的作用機制尚不明確，但炎癥反應是腦I/R損傷發(fā)病過程中的關鍵部分，有研究指出，減少炎癥因子的分泌或加強抗炎因子的表達可以縮小腦I/R損傷大鼠腦梗死體積，有助于神經功能恢復[3]。Toll樣受體4（TLR4）作為Toll樣受體識別系統(tǒng)，是一個參與固有免疫反應的模式識別受體蛋白，MyD88是TLR4介導炎癥通路重要的胞內接頭蛋白，可以募集下游信號分子的N端死亡結構域（Death domain,DD）和承接TLRs活化信號的C端TIR結構域，NF-κB是TLR4/MyD88下游的重要節(jié)點，參與轉錄調控，可導致炎癥因子釋放[4]。人參皂苷Rg1是人參的主要提取物之一，有研究發(fā)現，人參皂苷Rg1可以通過激活Nrf 2/ARE信號通路，減小腦I/R損傷大鼠的腦梗死體積[5]；也有研究表明，人參皂苷Rg1可以通過激活PPARγ/HO-1信號通路緩解腦I/R損傷大鼠神經元凋亡[6]。但關于人參皂苷Rg1是否通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮腦保護作用的研究較少。本研究通過建立腦I/R損傷大鼠模型，比較不同劑量的人參皂苷Rg1對腦I/R損傷大鼠的影響，為進一步探討人參皂苷Rg1對大鼠腦I/R損傷的保護作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周SPF級SD（Sprague Dawley）大鼠60只，重量為250～300g，來自牡丹江醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，動物許可證號為SYXK（黑）2019-006。大鼠自由獲取食物和水，室溫25℃恒定，模擬晝夜光照，在牡丹江醫(yī)學院比較醫(yī)學中心飼養(yǎng)（SCXK2019-003）。嚴格按照中國實驗動物管理法規(guī)處理動物,實驗中所有動物嚴格遵循3R原則。

1.2 試劑 人參皂苷Rg1購自上海源葉生物技術有限公司；大鼠白細胞介素1β（IL-1β）、大鼠白細胞介素6 （IL-6）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、ELISA試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master mix、ECL化學發(fā)光底物試劑盒均購自北京華諾德生物科技有限公司；一抗TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin、山羊抗兔二抗等以上抗體均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、給藥及模型的建立 將SD大鼠隨機分為4組：假手術組、腦I/R損傷模型組、低劑量給藥組（人參皂苷Rg1 30mg/kg）及高劑量給藥組（人參皂苷Rg1 60mg/kg），各15只。假手術組與腦I/R損傷模型組分別于術前每天1次腹腔內注射生理鹽水，低、高劑量給藥組每天1次腹腔內注射人參皂苷Rg1，連續(xù)給藥5天。末次給藥30min后，采用頸內動脈線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞引起腦I/R損傷模型，即在大鼠頸正中部做切口，暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈和頸外動脈，于頸總動脈分叉下方剪1個“V”形切口，將事先準備好的尼龍線栓輕輕插入頸內動脈18～20mm處，當感到有明顯阻力時，提示線栓已經栓在中動脈起始部位，達到阻塞動脈，即停止插栓線。阻閉90min后，將線栓緩慢拔出，恢復再灌注24h，形成大鼠腦I/R損傷。假手術組只暴露血管、縫合，不進行任何其他操作。

1.3.2 各組大鼠運動神經功能缺損評分比較 待腦I/R損傷24h后，觀察大鼠的精神狀態(tài)，根據Longa等[7]的評分標準對各組大鼠進行評分，0分：無神經系統(tǒng)損傷癥狀，活動正常；1分：提尾時，左前肢屈曲；2分：行走時身體向左側轉圈；3分：向左側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。各組大鼠運動神經功能缺損評分分值越高，提示大鼠神經功能障礙越嚴重，取1～3分大鼠用于后續(xù)實驗。

1.3.3 炎癥因子水平檢測 按照ELISA檢測試劑盒說明書中的操作步驟進行實驗操作。分別檢測各組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.3.4 qRT-PCR法檢測大鼠皮層腦組織中TLR4的表達 取各組大鼠的皮層腦組織樣本約100mg，提取皮層腦組織中總RNA，用超微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度。將提取的RNA逆轉錄成cDNA，經SYBR Green熒光染色法對各組大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA的表達情況進行測定。內參選取β-actin，以2-ΔΔCt法來對TLR4 mRNA表達情況進行計算。實驗中的所有引物均由英濰捷基上海貿易有限公司合成，TLR4基因的引物序列（5'-3'）為F:CTAGTCGACGAGATGGCGCTGCAT,R:CGCGGATCC ACTACAACAGGCAGATCAAC；β-actin基因的引物序列（5'-3'）為F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG。

1.3.5 Western blot檢測大鼠皮層腦組織中各目的蛋白水平的表達 取各組皮層腦組織樣本約100mg，加入0.2ml預冷的蛋白裂解緩沖液（RIPA組織-細胞快速裂解液∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1），用研磨棒在冰上充分研磨，4℃搖床充分裂解30min，4℃12 000r/min離心15min，吸取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組總蛋白的濃度。按照15μl上樣量含有40μg蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，濕法電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h后，分別加入MyD88（兔抗大鼠1∶500稀釋）、NF-κB（兔抗大鼠1∶1 000稀釋）、TLR4（兔抗大鼠1∶300稀釋）、β-actin（兔抗大鼠1∶2 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，PBST緩沖液（1 000ml PBS加入0.5ml Tween 20）洗滌3次，每次10min，加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋）孵育1h，PBST緩沖液洗滌3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，化學發(fā)光成像儀曝光、取像并測定條帶灰度值，各組灰度測定值與β-actin灰度值比值作為實驗結果。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法（One-way ANOVA），組間比較采用最小顯著性差異法（LSD），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠運動神經功能缺損評分比較 由于本實驗僅選擇神經功能缺損評分為1～3分的大鼠為實驗對象，根據每組的實際情況，從中選擇8只大鼠進行運動神經功能缺損評分的比較。腦I/R損傷模型組大鼠運動神經功能缺損評分為（2.13±0.64）分，明顯高于假手術組的0分（P＜0.01）；與腦I/R損傷模型組比較，低劑量給藥組大鼠運動神經功能缺損評分為（1.38±0.52）分稍低（P＜0.05），而高劑量給藥組大鼠運動神經功能缺損評分為（1.23±0.35）分明顯較低（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 在本實驗中，隨機從上述每組中各選6只大鼠對血漿進行TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平的檢測。與假手術組比較，腦I/R損傷模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯較高（P＜0.01）；與腦I/R損傷模型組相比，人參皂苷Rg1預處理的大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平隨著給藥劑量的增加而減少（P＜0.01），呈劑量相關。見表1。

表1 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平（±s，n=6）

表1 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平（±s，n=6）

注：與假手術組比較，*P＜0.01; 與腦I/R損傷模型組比較，#P＜0.01

組別 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） IL-1β（pg/ml）假手術組 4.51±2.53 34.75±5.83 57.07±25.85腦I/R損傷模型組 73.05±10.24* 114.69±27.02* 398.71±78.99*低劑量給藥組 41.41±14.54# 25.45±6.26# 156.59±36.22#高劑量給藥組 9.92±7.09# 10.04±2.47# 78.01±36.67#

2.3 各組大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA表達比較 與假手術組比較腦I/R損傷模型組大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA的表達明顯升高（P＜0.01）；與腦I/R損傷模型組比較，人參皂苷Rg1預處理的大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA的表達隨著給藥劑量的增加而減少（P＜0.01），呈劑量相關。見圖1。

圖1 各組大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA的表達

2.4 各組大鼠皮層腦組織中TLR4蛋白表達比較 與假手術組比較，腦I/R損傷模型組大鼠皮層腦組織中TLR4蛋白表達較高（P＜0.05）；與腦I/R損傷模型組比較，低劑量給藥組大鼠皮層腦組織TLR4蛋白的表達降低（P＜0.05），而高劑量給藥組大鼠皮層腦組織TLR4蛋白的表達顯著降低（P＜0.01），呈劑量相關。見圖2。

圖2 各組大鼠皮層腦組織中TLR4蛋白的表達

2.5 各組大鼠皮層腦組織中TLR4介導的通路蛋白表達比較 與假手術組比較，腦I/R損傷模型組大鼠皮層腦組織中MyD88、NF-κB蛋白的表達增加（P＜0.05）；與腦I/R損傷模型組比較，低劑量給藥組大鼠皮層腦組織中MyD88、NF-κB蛋白的表達降低（P＜0.05），而高劑量給藥組大鼠皮層腦組織中MyD88、NF-κB蛋白的表達顯著降低（P＜0.01），呈劑量相關。見圖3。

圖3 各組大鼠皮層腦組織中MyD88、NF-κB蛋白的表達

3 討論

腦I/R損傷是指腦組織缺血一定時間后再恢復血液灌注，使腦組織細胞出現了損傷加重，甚至造成不可逆損傷的現象。近年，中藥提取物對腦I/R損傷防治作用的相關報道越來越多[8，9]。其中人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，因具有抗氧化、抗凋亡、神經保護等藥理學活性而被廣泛關注[10]。本實驗發(fā)現人參皂苷Rg1可以明顯降低腦I/R損傷大鼠的運動神經功能缺損評分，這與相關實驗結果一致[11]，提示人參皂苷Rg1有助于腦I/R損傷大鼠的神經功能恢復。腦I/R損傷病理生理機制復雜，是多種因素共同作用的結果。有研究發(fā)現通過誘導自噬，可以增加腦I/R損傷大鼠的腦含水量，減少腦梗死體積，緩解I/R損傷[12]；也有研究發(fā)現，通過抑制神經元CA3區(qū)細胞內的鈣離子，可以保護神經元免受I/R引起的腦損傷[13]。同樣，炎癥反應也參與腦I/R損傷過程，炎癥反應是機體內白細胞和化學因子對抗損傷保護機體的過程，任何作用于機體的損傷都必將引發(fā)一系列的炎癥反應。當腦I/R損傷發(fā)生時，中性粒細胞聚集在毛細血管內皮，同時破壞血腦屏障，引起腦內炎癥介質的釋放，加重腦損傷。而TLR4是介導腦I/R損傷的關鍵治療靶點之一，TLR4是第一個Toll樣受體蛋白，可以通過誘導NF-κB控制基因的表達激活適應性免疫[14]。當TLR4激活時，TLR4和MyD88通過促進腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）活化，最終導致NF-κB激活，進而誘導炎癥因子的表達和釋放，引起組織的進一步損傷[15～17]。TNF-α、IL-1β、IL-6是重要的炎癥因子，有研究證明TNF-α、IL-1β、IL-6過度釋放會加重腦I/R損傷，阻斷TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放，對腦I/R損傷SD大鼠具有保護作用[18]。本研究中，通過ELISA法檢測各組大鼠血漿中TNF-α、IL-6、IL-1β因子的含量發(fā)現，人參皂苷Rg1預處理過的大鼠會降低血漿中這三種炎癥因子的表達，表明人參皂苷Rg1可以通過抑制炎癥因子的釋放發(fā)揮神經保護作用，而這種保護作用必然會涉及到相關炎癥通路的改變。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是一條重要的調節(jié)炎癥反應的通路，有研究表明，龍膽苦苷通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，降低腦I/R損傷后的炎癥反應，從而發(fā)揮抗腦I/R損傷的作用[19]；雷帕霉素通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路降低腦I/R損傷的炎癥反應，抑制腦I/R損傷誘導的神經元凋亡,防止神經元變性[20]。為了驗證人參皂苷Rg1是否也能介導TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮抗腦I/R損傷的作用，我們進行qRTPCR檢測各組大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA的表達、Western blot檢測大鼠皮層腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達。發(fā)現當腦I/R損傷發(fā)生時，大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA、蛋白以及MyD88、NF-κB蛋白的表達顯著提高，而用人參皂苷Rg1預處理的大鼠皮層腦組織中TLR4 mRNA、蛋白以及MyD88、NF-κB蛋白的表達明顯減少，且呈劑量相關，提示當腦I/R損傷發(fā)生時，人參皂苷Rg1通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的釋放，發(fā)揮神經保護作用。

綜上，人參皂苷Rg1具有良好的抗腦I/R損傷的作用，其機制可能與抑制TLR4介導的MyD88/NF-κB信號通路有關。