基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學研究黃芪與黃蜀葵花配伍治療糖尿病腎病的作用機制

吳波 喻志陽 王玥坤 張伶俐 陳醒 魏瑋 高茗 藍曉紅

糖尿病腎病（Diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，我國DKD患病率在糖尿病患者中占30%～50%，且呈逐漸上升趨勢，成為終末期腎病的首位病因[1]。西醫(yī)學認為DKD的發(fā)病機制是由于機體糖代謝異常，血糖濃度過高促使腎臟血液動力學發(fā)生改變，腎小球濾過率降低，腎小管重吸收下降，出現(xiàn)蛋白尿、血尿、水腫等癥狀[2]。針對DKD的治療，糖尿病腎臟病防治指南及專家共識推薦控制血糖、血壓、血脂，減少尿蛋白為主，還包含生活方式干預(yù)、治療腎功能不全的并發(fā)癥以及透析治療等。降血糖藥物常用二甲雙胍，但因腎功能不全導致二甲雙胍無法排泄，易造成乳酸堆積，嚴重者可能發(fā)生乳酸性中毒；ARB/ACEI用于高血壓伴大量蛋白尿優(yōu)于其他降壓藥物，但容易造成高血鉀，嚴重者甚至出現(xiàn)心律失常，對伴有慢性心功能不全患者造成嚴重危害。中醫(yī)藥是我國文化瑰寶之一，其控制DKD的發(fā)展療效確切，因而不少學者提出將中醫(yī)與西醫(yī)結(jié)合診治DKD[3，4]。有研究顯示[5]，黃芪與黃蜀葵花配伍后，能顯著降低患者尿蛋白水平，延緩DKD的發(fā)展，但其作用機制及主要活性成分尚不清楚。作者借助網(wǎng)絡(luò)藥理學與生物信息學的方法，探究黃芪與黃蜀葵花配伍治療DKD活性成分、重要靶點及潛在信號通路，為臨床應(yīng)用和深入研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 常用數(shù)據(jù)庫及軟件 本研究用到的數(shù)據(jù)庫有：TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp search.php），String（https://cn.string-db.org/），David（https://david.ncifcrf.gov/），UniProt（https://www.uniprot.org/），Gene Cards（https://www.genecards.org/），GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）。用到的軟件有：RStudio，R3.5，Cytoscape3.7，AutoDock4.6，SangBox，PyMol，OpenBabel。

1.2 黃芪、黃蜀葵花的活性成分及靶點 檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）獲得黃芪、黃蜀葵花的化學成分，設(shè)置篩選條件為口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18。檢索活性成分作用的靶點信息，并在UniProt數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)換成靶點。

1.3 DKD相關(guān)靶點及差異基因的篩選 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中搜索“diabetic kidney disease”，獲得與DKD相關(guān)的靶點信息。在GEO數(shù)據(jù)庫中，搜索與DKD相關(guān)的芯片，并用GEO2R在線分析工具分析芯片數(shù)據(jù)，得到關(guān)于DKD的表達基因。設(shè)置P＜0.05，log|FC|≥1為篩選條件，獲得DKD差異表達基因。

1.4 “黃芪—黃蜀葵花—DKD—活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的活性成分及其對應(yīng)的靶點導入到Cytoscap3.7軟件，構(gòu)建“黃芪—黃蜀葵花—DKD—活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)。將活性成分對應(yīng)的靶點與GeneCards和GEO獲取的靶點放在一起，取交集，得到共同靶點，隨后構(gòu)建共同靶點與其對應(yīng)的活性成分網(wǎng)絡(luò)。

1.5 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 將共同靶點上傳到String數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人，選擇綜合得分（Combined score）＞0.4的連結(jié)關(guān)系，得到共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將String平臺得到的結(jié)果導入Cytoscape3.7軟件，利用“Cytohubba”和“MCODE”插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，篩選關(guān)鍵靶點。

1.6 關(guān)鍵靶點的GO分析和KEGG信號通路富集分析 在David數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵靶點，設(shè)置物種為人，基因表型為Office Gene Symbol，得到關(guān)鍵靶點的GO和KEGG富集通路。

1.7 關(guān)鍵靶點與活性成分的分子對接 用PyMol軟件將關(guān)鍵靶點（蛋白）去水分子和配體，用AutoDock進行加氫，計算電荷，設(shè)置原子屬性，保存為pdbqt格式。在PubChem平臺上獲取活性成分或原配體的結(jié)構(gòu)式，保存2D SDF文件，同時用OpenBable轉(zhuǎn)換成mol2格式。利用AutoDock將活性成分或原配體進行加氫，計算電荷，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，保存為pdbqt格式。設(shè)置GridBox的格子大小能包含靶點與化合物（原配體），運算模式選擇馬克算法，保存為dpf格式。設(shè)置靶點為剛性分子，化合物（原配體）為對接分子，對接方法默認，保存為gpf格式。最后查看dlg格式文件，打開靶點，進行rank energy，獲得分子對接結(jié)果為pdbqt格式，用OpenBable轉(zhuǎn)換成pdb格式，用PyMol查看對接。

2 結(jié)果

2.1 黃芪、黃蜀葵花活性成分 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，設(shè)置口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，一共獲得22個活性成分，黃芪有18個，黃蜀葵花有5個，其中槲皮素存在于兩味藥中。見表1。

表1 黃芪和黃蜀葵花活性成分

2.2 差異表達基因的火山圖和熱圖 利用GEO2R在線分析平臺對GSE30529芯片兩組數(shù)據(jù)（DKD組、空白對照組）進行分析，得到的結(jié)果用R語言中的“volcano”函數(shù)進行火山圖繪制，所得結(jié)果見圖1A。將TCMSP、GeneCards和GEO數(shù)據(jù)庫得到的靶點取交集，獲得共同靶點，見圖1B；利用R語言“heatmap”函數(shù)對共同靶點進行聚類分析，得到共同靶點的熱圖，見圖1C。火山圖顯示樣本里的全部基因，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，黑色表示差異不顯著；熱圖表示的是共同靶點基因在每個樣本里的表達情況。

圖1A GSE30529芯片火山圖

圖1B 共同靶點韋恩圖

圖1C 共同靶點熱圖

2.3 構(gòu)建黃芪、黃蜀葵花和糖尿病腎病的“活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)” 借助Cytoscape3.7分別構(gòu)建黃芪、黃蜀葵花的“活性成分—靶點”及“活性成分—DKD—共同靶點”網(wǎng)絡(luò)。“活性成分—靶點”包含227個節(jié)點，494條邊，利用“Network Analyzer”插件對網(wǎng)絡(luò)進行分析，得到該網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)，活性成分中槲皮素（MOL000098）和山奈酚（MOL000422）在網(wǎng)絡(luò)中的Degree排名最前，提示槲皮素和山奈酚可能是黃芪、黃蜀葵花主要的活性物質(zhì)（見圖2A）。隨后將化合物對應(yīng)的共同靶點挑選出來，用Cytoscape3.7構(gòu)建“活性成分—DKD—共同靶點”網(wǎng)絡(luò)（見圖2B），圖中包含25個節(jié)點，47條邊。

圖2A 活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2B 活性成分—DKD—共同靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述得到的共同靶點導入String數(shù)據(jù)庫，獲得共同靶點的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3A），為了便于挖掘核心靶點，則將String數(shù)據(jù)的結(jié)果保存為csv格式，并借助Cytoscape3.7軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，為了排除計算結(jié)果的差錯，選取了“Cytohubba”和“MCODE”兩種算法進行分析（見圖3B、3C），關(guān)鍵靶點涉及EGF、CASP3、CCL2、ICAM1、VCAM1、CXCL10、STAT1和SPP1。

圖3A 共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3B Cytohubba算法的關(guān)鍵基因

圖3C MCODE算法的關(guān)鍵基因

2.5 GO富集和KEGG通路分析 采用David數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中19個靶標蛋白對應(yīng)的基因進行GO與KEGG通路富集分析，GO富集包含生物過程（Biological process，BP）、細胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）。生物過程涉及細胞對環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對缺氧反應(yīng)、對脂多糖反應(yīng)、細胞粘附、負責轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、血管生成負調(diào)控和對細胞外滲的正調(diào)控等；細胞成分涉及細胞外間隙、膜筏、質(zhì)膜外側(cè)、細胞質(zhì)核周區(qū)和核質(zhì)等；分子功能涉及修復綁定、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、雄激素受體結(jié)合和相同蛋白結(jié)合等。選取P值排名前20的條目，用R語言繪制GO條目氣泡圖（見圖4A）。

KEGG富集到25條信號通路（P＜0.05），主要包括：腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、癌癥通路、膀胱癌通路、Erb B通路、MAPK信號通路和Toll樣信號通路等（見圖4B）。

圖4A GO條目氣泡圖（前20）

圖4B KEGG信號通路氣泡圖（前20）

2.6 分子對接驗證 上述分析結(jié)果顯示槲皮素和山奈酚在黃芪、黃蜀葵花組方中起到主要作用，在PubChem數(shù)據(jù)中查詢兩種成分，與關(guān)鍵靶點進行分子對接（選取得分排在前四靶點蛋白），與原配體進行比較，活性成分與1CAM1和EGF靶點對應(yīng)的蛋白結(jié)合更加緊密。槲皮素、山奈酚與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果可視化展示見表2、圖5。

表2 槲皮素、山奈酚與關(guān)鍵靶點分子對接（kcal/mol）

圖5 槲皮素、山奈酚與1CAM1和EGF蛋白分子對接圖

3 討論

中藥既可減少DKD患者尿蛋白，又可降低血糖、血肌酐、改善脂質(zhì)代謝，一定程度上延緩DKD的發(fā)生、發(fā)展[6，7]，被廣泛運用于慢性腎臟病防治[8]。黃芪、黃蜀葵花不僅可以與其他中藥配伍使用，也可以作為單味藥使用[9,10]。黃芪作為傳統(tǒng)補氣中藥，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有降血糖、抗病毒、抗氧化、清除自由基和調(diào)節(jié)免疫等多方面藥理作用[11]。何麗珍[12]將黃芪用于糖尿病腎病的輔助治療，將實驗組（黃芪結(jié)合西醫(yī)治療）與對照組（常規(guī)西醫(yī)治療）進行比較，實驗組的尿蛋白、空腹血糖和血尿素氮顯著降低。路亮[13]通過對比治療組（黃芪湯聯(lián)合常規(guī)治療）與對照組（常規(guī)治療），發(fā)現(xiàn)治療組的24h尿蛋白定量、尿白蛋白/尿肌酐（UACRR）及血清炎癥遞質(zhì)低于對照組。黃蜀葵花具有清熱利濕、解毒排濁的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有減輕DKD炎癥反應(yīng)、抑制纖維化細胞因子表達、改善微循環(huán)以及保護腎小管上皮細胞等功效，廣泛運用于DKD治療[14，15]。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學，分析預(yù)測黃芪、黃蜀葵花配伍治療DKD的潛在藥理機制，發(fā)現(xiàn)兩味藥含有22個活性成分參與調(diào)控疾病，其中與DKD相關(guān)的主要活性成分是槲皮素和山奈酚，參與調(diào)控的關(guān)鍵靶點有19個，這些靶點基因主要集中在腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路和癌癥通路等與腎小球上皮細胞生長、凋亡密切相關(guān)通路，此外，還富集了MAPK、Toll樣信號通路與炎癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示黃芪、黃蜀葵花配伍可能通過多成分、多靶點、多途徑的方式干預(yù)DKD的發(fā)展。

既往研究表明，槲皮素具有抗纖維化、抗氧化、抗過敏、抗血栓、抗炎、抗菌、抗病毒及清除體內(nèi)自由基等多方面的藥理作用[16]。陳晶波[17]研究吡格列酮與黃酮類藥物抑制2型糖尿病大鼠腎臟泛素蛋白酶復合體系統(tǒng)介導NF-κB活化時發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過改善糖脂代謝、降低氧化應(yīng)激、減少蛋白尿發(fā)生、抑制NF-κB p65表達等途徑減輕糖尿病大鼠腎臟病理改變，延緩疾病進程。山奈酚又稱山奈黃素，廣泛存在于植物的根、葉和果實中，具有抗氧化、抗癌及預(yù)防心血管疾病等多種藥理活性[18]。孔令希[19]研究山奈酚抗動脈粥樣硬化作用機理及其藥代動力學發(fā)現(xiàn)，不同濃度的山奈酚能顯著降低家兔血清血脂水平，與模型組比較，顯著下調(diào)血管炎性分子選擇素（E-sel）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達水平。

表2所示槲皮素、山奈酚與ICAM-1和EGF的結(jié)合程度高于原配體，推測兩種活性成分通過調(diào)控ICAM-1和EGF靶點來延緩DKD惡化發(fā)展。細胞間黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成員，在穩(wěn)定細胞間相互作用和促進白細胞、內(nèi)皮細胞的遷移起著重要作用，參與細胞信號傳導與活化、細胞組織生長、炎癥反應(yīng)及血管生成等生理病理過程。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是人體重要的細胞因子，參與調(diào)控表皮細胞或內(nèi)皮細胞增殖、分化，促進創(chuàng)面修復和愈合。圖1C所示DKD患者EGF表達低于正常組，提示DKD患者腎臟損傷修復下降。與此同時，ICAM-1表達高于正常組，提示DKD患者腎臟免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)高于正常組。此外，KEGG富集的主要通路是腫瘤壞死因子信號通路，該通路與DKD的發(fā)展有著密切聯(lián)系[20]。

本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學、生物信息學結(jié)合分析黃芪、黃蜀葵花治療DKD的作用機制，挖掘潛在的活性成分及作用靶點，并用分子對接技術(shù)驗證數(shù)據(jù)的可靠性，且預(yù)測數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻報道一致，具有一定的科學指導性。現(xiàn)階段，山奈酚的臨床研究鮮有報道，能否用于臨床仍需加大研究樣本進行臨床實驗驗證。網(wǎng)絡(luò)藥理學的篩選是根據(jù)口服利用度和類藥性，其中可能忽略了其他的活性成分，隨著計算機技術(shù)和生物信息技術(shù)的發(fā)展，潛在的分子機制、作用靶點會逐漸被發(fā)現(xiàn)。