HPV16感染與宮頸癌的相關性及對ERK1/2信號通路的影響

任燕祥

宮頸癌為臨床常見的婦科惡性腫瘤，發病率和死亡率均位列我國婦科惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[1]。人乳頭狀瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染為目前公認的宮頸癌重要致病因素之一，HPV種類多樣，已知200多種亞型，其中人乳頭狀瘤病毒16型（HPV16）屬高危型病毒，該亞型持續性感染在宮頸癌形成及惡化過程中發揮重要作用[2]。胞外信號調節激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）信號通路為一種與腫瘤形成關系密切的通路，在癌細胞增殖、分化、侵襲、轉移等過程中扮演重要角色，其異常活化可見于乳腺癌、前列腺癌、胃癌、宮頸癌等[3～5]。既往研究報道[6]，HPV16感染能夠激活ERK1/2信號通路，但其是否通過該通路參與宮頸癌的發生發展仍需進一步探索研究。為此，本研究探討了HPV16感染與宮頸癌的相關性及對ERK1/2信號通路的影響，希望為宮頸癌診治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 一般資料 經我院醫學倫理委員會批準，選取2019年5月～2021年5月我院收治的113例宮頸癌患者作為研究對象。年齡30～80歲，平均（58.82±5.63）歲；孕1～3次，平均（2.11±0.52）次；平均體質指數（22.36±2.19）kg/m2；有吸煙史22例，有飲酒史35例；淋巴結轉移46例；腫瘤分化程度：高分化80例，中低分化33例。納入標準：①經病理學檢查確診為宮頸癌[7]；②入院前未行放、化療治療；③無其他部位腫瘤，無精神障礙性疾病；④病歷資料齊全；⑤知情同意本研究。排除標準：①心、腦、肺、肝、腎等器官功能異常者；②認知功能障礙者；③合并血液病者；④依從性差，無法配合本次研究者。

1.2 方法 收集患者腹腔鏡宮頸癌根治術中切除的癌組織和癌旁2cm正常組織。比較癌組織和癌旁正常組織內HPV16感染陽性率，比較不同FIGO分期及病理特點的宮頸癌患者HPV16感染陽性率，采用免疫組化染色法和Western blotting法檢測磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織內的表達情況，比較不同FIGO分期及病理特點的宮頸癌患者p-ERK1/2蛋白表達情況，分析p-ERK1/2蛋白表達水平與宮頸癌患者FIGO分期及病理特點的相關性。

1.2.1 HPV16感染陽性率檢測 行PCR-DNA反向雜交實驗，即取石蠟包埋的癌組織和癌旁正常組織標本，依據試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）說明書提取HPV16-DNA，并行PCR擴增、雜交，然后洗膜、顯色。陽性判讀：雜交膜條上除IC位點和顯色反應控制點外，僅HPV基因型位點顯藍色，其它位點不顯色[8]。

1.2.2 免疫組化染色法 癌組織和癌旁正常組織切片經二甲苯（上海鈺博生物科技有限公司，批號XG-R197052）脫蠟和梯度乙醇（上海西格生物科技有限公司，批號ZSG-442298）水化，然后行微波抗原修復，經3%H2O2滅活內源性酶，經山羊血清（北京伊塔生物科技有限公司，批號YT2525）封閉0.5h，然后滴加p-ERK1/2一抗（1∶200，北京澤平科技有限責任公司，批號BS65784），4℃孵育過夜，洗凈切片，滴加通用型二抗（1∶2000，上海雅酶生物科技有限公司，批號PS119），37℃孵育60min，DAB試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司，批號IC-DAB1-Ra）顯色，蘇木精（北京伊塔生物科技有限公司，批號YT1086）復染，洗滌，脫水，透明，封固，雙盲法讀片。判定標準：隨機選擇5個視野，陽性細胞比例≤10%判定為0分，11%～25%判定為1分，26%～50%判定為2分，51%～75%判定為3分，＞75%判定為4分；染色強度：淺黃記為1分，黃色記為2分，深黃記為3分。陽性細胞比例分數×染色強度分數＞6分定義為陽性表達，反之為陰性表達[9]。

1.2.3 Western blotting法 膜蛋白提取依據試劑盒 （武漢純度生物科技有限公司，批號CD-02199-ML）說明進行操作，BCA法及相應試劑盒（上海吉至生化科技有限公司，批號FT-D24505）測定總蛋白含量。取膜蛋白，在SDS-PAGE凝膠內被分離轉至PVDF膜，用p-ERK1/2一抗（1∶400，上海圻明生物科技有限公司，批號mYF4837），β-actin一抗（1∶500，北京百奧萊博科技有限公司，批號YT672-WXO）進行雜交，然后經辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記的特異性二抗（1∶2000，北京百奧萊博科技有限公司，批號WK355-FOV）孵育60min，用ECL化學發光液（上海齊源生物科技有限公司，批號QY-SH32179）檢測蛋白條帶，使用Image Quant350成像儀（上海美盛自動化設備有限公司）以及Image Quant TL-1軟件對光密度進行分析定量。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件對數據進行分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織和癌旁正常組織內HPV16感染陽性率比較 宮頸癌組織內HPV16感染陽性率為84.07%（95/113），顯著高于癌旁正常組織的4.42%（5/113）（χ2=145.286，P＜0.001）；不 同FIGO分期、有無淋巴結轉移、不同腫瘤分化程度的宮頸癌患者HPV16感染陽性率差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同FIGO分期、有無淋巴結轉移、不同腫瘤分化程度的宮頸癌患者HPV16感染陽性率比較

2.2 免疫組化染色檢測p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達情況 免疫組化染色結果顯示，p-ERK1/2蛋白定位于胞質或胞核，呈棕黃色或黃褐色顆粒（見圖1）。113例宮頸癌組織中p-ERK1/2蛋白陽性表達者89例，占78.76%，而相應的癌旁正常組織內p-ERK1/2蛋白陽性表達者9例，占7.96%，差異具有統計學意義（χ2=115.306，P＜0.001）。

圖1 p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織內的表達（×400）

2.3 Western blotting檢測p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達 Western blotting結果顯示，p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達量分別為5.58±1.22、0.92±0.36，宮頸癌組織內p-ERK1/2蛋白表達量顯著高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義（t=38.944，P＜0.001）見圖2。

圖2 Western blotting檢測p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織內的表達

2.4 不同FIGO分期及病理特點的宮頸癌患者p-ERK1/2蛋白表達比較 FIGO分期ⅡA～ⅡB、有淋巴結轉移、腫瘤中低分化程度、HPV16感染患者癌組織內p-ERK1/2蛋白表達量顯著高于FIGO分期IA～IB、無淋巴結轉移、腫瘤高分化程度、非HPV16感染患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.5 相關性分析 p-ERK1/2蛋白表達水平與宮頸癌淋巴結轉移、高FIGO分期、中低分化程度、HPV16感染呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表2 不同FIGO分期及病理特點宮頸癌患者p-ERK1/2蛋白表達情況（±s）

表2 不同FIGO分期及病理特點宮頸癌患者p-ERK1/2蛋白表達情況（±s）

病理特點 n p-ERK1/2蛋白 t P FIGO分期 7.931 ＜0.001ⅠA～ⅠB 84 4.23±0.95ⅡA～ⅡB 29 6.67±1.56淋巴結轉移 9.964 ＜0.001無67 4.18±0.86有46 6.78±1.62腫瘤分化程度 7.632 ＜0.001高分化 80 4.41±0.99中低分化 33 6.55±1.48 HPV16感染 8.020 ＜0.001無18 4.50±0.82有95 6.61±1.74

表3 不同病理特點和p-ERK1/2蛋白表達相關性分析

3 討論

HPV為一種球形DNA病毒，由DNA核心和蛋白外殼組成，感染途徑有性傳播、醫源性感染和母嬰傳播等，在14～59歲人群中感染率為26.8%[10]。目前已知的200多種亞型中，約有40種和生殖道疾病的發生有關，這40種HPV亞型可繼續分類為低危型與高危型，低危型可引起某些良性病變如尖銳濕疣，而高危型HPV亞型，如HPV16通常和宮頸病變有關，是宮頸癌形成的關鍵誘因之一[11，12]。本次研究結果顯示，宮頸癌組織內HPV16感染陽性率（84.07%）顯著高于癌旁正常組織（4.42%），FLGOⅡA～ⅡB期、淋巴結轉移、腫瘤中低分化程度患者HPV16感染陽性率顯著高于FLGOⅠA～ⅠB期、無淋巴結轉移、腫瘤高分化程度的患者，表明HPV16感染與宮頸癌發生和發展顯著相關，這與既往研究一致[13]。然而，宮頸癌惡性轉化并非HPV感染這一單方面因素所致，宮頸癌發生和發展是環境、遺傳、基因、生物等多因素相互作用的結果，該過程中機體感染HPV后，抑癌基因失活、促癌基因激活、細胞內信號通路激活等一系列過程被啟動，繼而使細胞生物學行為發生異常變化，如異常增殖、侵襲、轉移等，最終引發宮頸癌[14]。

ERK1/2通路為細胞內十分重要的信號轉導通路，ERK1/2通路中相關蛋白分子表達異常會促使癌細胞增殖、侵襲，在惡性腫瘤發生和病情進展中發揮作用。研究發現[15]，ERK1/2活化后可通過干擾合成嘧啶核苷酸、構建染色質及蛋白質翻譯而引起細胞大量增殖，促進細胞周期進展；還可通過干擾腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）發揮抗凋亡效應，從而促進癌細胞生長、分裂及向惡性轉化。本次研究采用免疫組化染色法和Western blotting法檢測p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達情況，結果均顯示p-ERK1/2蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，進一步分析發現FIGO分期ⅡA～ⅡB、有淋巴結轉移、腫瘤中低分化程度、HPV16感染患者癌組織內p-ERK1/2蛋白表達量顯著高于FIGO分期IA～IB、無淋巴結轉移、腫瘤高分化程度和無HPV16感染的患者，提示ERK1/2信號通路的激活在宮頸癌發生和病情進展過程中有促進作用，可能會促使宮頸癌浸潤、侵襲及轉移。此外，HPV16感染患者癌組織內p-ERK1/2蛋白表達量顯著高于無HPV16感染患者，相關性分析顯示p-ERK1/2蛋白表達水平與宮頸癌患者HPV16感染呈正相關，作者認為可能是HPV16介導ERK1/2通路而參與宮頸腫瘤形成及其向宮頸浸潤癌轉變。Silva等[16]研究顯示，宮頸上皮HPV感染之后，HPV的致癌蛋白（E6、E7）能夠持續表達，推動宮頸病變進展。Cheng等[17]研究發現，ERK1/2通路能夠參與突變Ras基因所致的宮頸癌Hela細胞增殖。因此，宮頸癌臨床治療干預時，可考慮從清除HPV16及抑制ERK1/2通路入手，以改善宮頸癌患者預后。

綜上所述，HPV16感染可能通過持續活化ERK1/2信號通路，促使宮頸癌發生和發展，然而本次研究僅為臨床初步分析，處于組織學水平，有待行基礎實驗基于細胞學水平進一步深入探討。