正交試驗(yàn)法優(yōu)選抗早顆粒提取及成型工藝*

錢 芳，陳 煜

（江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210029）

性早熟為生長(zhǎng)發(fā)育異常疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身心健康，影響兒童的身體發(fā)育。抗早顆粒為我院兒科的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃柏、知母、枳殼、陳皮等中藥組方，具有健脾化痰、滋陰降火之功效，用于痰火互結(jié)型性早熟。臨床應(yīng)用以湯劑為主，療效確切，但服用、攜帶、貯存均不方便。中藥顆粒劑服用、攜帶、貯藏均較方便，吸收較快，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，故擬將湯劑開發(fā)成顆粒劑。本研究中以鹽酸小檗堿含量和干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選抗早顆粒的提取工藝；以顆粒得率和水分為指標(biāo)，在單因素考察基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選抗早顆粒的成型工藝，為醫(yī)院制劑的規(guī)范化生產(chǎn)和后期的藥學(xué)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，以確保臨床用藥安全有效。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100 型液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有G1322A 型脫氣機(jī)，G1311A 型四元泵，G1316A 型柱溫箱，G1314A 型VWD 檢測(cè)器，Agilent ChemStation 工作站；BP - 211D 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；WBF - Ⅱ型多功能流化床實(shí)驗(yàn)機(jī)（重慶英格造粒包衣技術(shù)有限公司）；SH10A 型快速水分測(cè)定儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；PL-S40T 型超聲波清洗機(jī)（東莞康士潔超聲波科技有限公司，功率為240 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110713 - 201212，純度為86.7%）；黃柏（批號(hào)為20191002），知母（批號(hào)為19012603），枳殼（批號(hào)為191202），陳皮（批號(hào)為19120806），夏枯草（批號(hào)為200101），均購(gòu)于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司；糊精（安徽山河藥用輔料公司，批號(hào)為200310）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司，批號(hào)為1758107446）。

2 方法與結(jié)果

2.1 君藥黃柏中鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 0.1%磷酸溶液（45∶55，V/V），每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm［1］；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按此色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同位置有相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，鹽酸小檗堿峰分離度大于1.5。

2.1.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對(duì)照品，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含鹽酸小檗堿452.23 μg的溶液，以流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度為13.567 μg/ mL 的溶液，即得對(duì)照品溶液。稱取處方量飲片88 g，加10 倍量水，煎煮2 次，每次40 min，濾過(guò)，合并2 次濾液，濃縮至150 mL，即得樣品貯備液；精密吸取此樣品貯備液5 mL，置25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相，超聲處理（功率為240 W，頻率為40 kHz）20 min，放冷，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法制備缺黃柏的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察與與檢測(cè)限、定量限確定：精密吸取上述對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度13.567 μg/ mL）3，5，10，20，30，40，50 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 3 979.1X- 0.920 2，r= 1.000 0（n= 7）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.040 7～0.678 4 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加流動(dòng)相稀釋，得質(zhì)量濃度分別為9.04，4.52，0.90，0.45，0.22，0.11 μg/mL的系列溶液，測(cè)定基線噪音。分別按信噪比（S/N）3∶1和10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢測(cè)限和定量限。結(jié)果鹽酸小檗堿的檢測(cè)限和定量限分別為0.11 μg/ mL 和0.45 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為13.567 μg/ mL）10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積，日內(nèi)精密度的RSD為0.50%（n=6）；連續(xù)進(jìn)樣6 d，計(jì)算峰面積，日間精密度的RSD為0.95%（n= 6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下樣品貯備液5 mL，共6 份，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以鹽酸小檗堿含量計(jì)算，結(jié)果的RSD為1.61%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下樣品貯備液適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.78%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下樣品貯備液2.5 mL，共6 份，分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為452.23 μg/ mL），依法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.06%，RSD為0.56%（n=6）。

2.2 水提工藝研究

2.2.1 干膏得率

精密吸取2.1.2 項(xiàng)下樣品貯備液2 mL，蒸干，105 ℃干燥3 h，放入干燥器冷卻30 min，稱定質(zhì)量。干膏得率（%）=（W×V1）/（W1×V2）× 100%。式中，W為干膏質(zhì)量，V1為濃縮液總體積，W1為藥材總質(zhì)量，V2為取樣體積。

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，取處方量飲片，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)提取時(shí)間（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、加水量（因素C）進(jìn)行考察。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 水提工藝因素與水平Tab.1 Factors and levels of water extraction process

2.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

取處方量飲片，以L9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，以干膏得率（a）和鹽酸小檗堿含量（b）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法計(jì)算綜合評(píng)分，權(quán)重系數(shù)分別為0.3和0.7。綜合評(píng)分=（a/amax）×30+（b/bmax）×70，以此評(píng)分作為篩選指標(biāo)。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2至表3。

表2 水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the orthogonal test of water extraction process

表3 水提工藝方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA of the water extraction process

由表3 可知，因素A、因素C 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，因素B 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，影響由大到小為B ＞A ＞C；由表2 可知，不同水平影響由大到小為A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2。由此，確定最佳水提工藝為A2B3C1。綜合考慮降低生產(chǎn)成本和縮短生產(chǎn)周期等，優(yōu)選水提工藝為A2B2C1，即加8 倍量水，提取2次，每次40 min。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3 份處方量飲片，按優(yōu)選工藝提取。由表4 可知，優(yōu)選的工藝可行。

表4 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the validation test of water extraction process

2.3 成型工藝優(yōu)選

2.3.1 顆粒得率

稱定制得顆粒的質(zhì)量，收集能通過(guò)1號(hào)篩但不能通過(guò)5 號(hào)篩［2］的顆粒。顆粒得率（%）= 過(guò)篩后顆粒質(zhì)量/過(guò)篩前顆粒質(zhì)量×100%。

2.3.2 顆粒水分

取顆粒5 g，精密稱定，置快速水分測(cè)定儀測(cè)定，讀數(shù)。

2.3.3 單因素考察

浸膏相對(duì)密度：稱取糊精，置流化床制粒機(jī)底部，按2.2.3項(xiàng)下優(yōu)選水提工藝提取，濃縮所得浸膏調(diào)成相對(duì)密度分別為1.10，1.15，1.20（60 ℃），調(diào)節(jié)噴霧速率、霧化壓力、物料溫度等，使物料保持沸騰。結(jié)果浸膏相對(duì)密度為1.15（60 ℃）時(shí)制得顆粒質(zhì)量較好。詳見(jiàn)表5。

噴霧速率：稱取糊精，置流化床制粒機(jī)底部，將浸膏調(diào)成相對(duì)密度為1.15（60 ℃），調(diào)節(jié)噴霧速率分別為10，20，30 r/min，調(diào)節(jié)霧化壓力、物料溫度等，使物料保持沸騰。結(jié)果噴霧速率為20 r/ min 時(shí)制得顆粒質(zhì)量較好。詳見(jiàn)表5。

表5 抗早顆粒浸膏成型工藝單因素考察結(jié)果Tab.5 Results of the single- factor investigation for forming process of Kangzao Granules extract

霧化壓力：稱取糊精，置流化床制粒機(jī)底部，調(diào)節(jié)浸膏相對(duì)密度為1.15（60 ℃），噴霧速率為20 r/ min，調(diào)節(jié)霧化壓力分別為0.08，0.12，0.16 MPa，調(diào)節(jié)物料溫度等，使物料保持沸騰。結(jié)果霧化壓力在0.12～0.16 MPa 之間較合適。詳見(jiàn)表5。

物料溫度：稱取糊精，置流化床制粒機(jī)底部，調(diào)節(jié)浸膏相對(duì)密度為1.15（60 ℃），噴霧速率為20 r/min，霧化壓力為0.12 MPa，調(diào)節(jié)物料溫分別度為40，50，60，70 ℃，使物料保持沸騰。結(jié)果物料溫度為50～60 ℃較合適。詳見(jiàn)表5。

2.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素考察結(jié)果，將浸膏調(diào)成相對(duì)密度為1.15（60 ℃），采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)霧化壓力（因素A）、噴霧速率（因素B）、物料溫度（因素C）進(jìn)行考察。因素與水平見(jiàn)表6。

表6 流化床制粒工藝因素與水平Tab.6 Factors and levels of the fluidized bed granulation process

2.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

將糊精置流化床制粒機(jī)底部，取抗早顆粒浸膏，按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)進(jìn)行制粒，以顆粒得率和水分為考察指標(biāo)。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表7至表8。

表7 流化床制粒工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.7 Design and results of the orthogonal test of fluidized bed granulation process

表8 流化床制粒工藝方差分析結(jié)果Tab.8 Results of ANOVA of the fluidized bed granulation process

可知，以顆粒得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素A、因素B 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素C 無(wú)顯著影響，影響由大到小為A ＞B ＞C；不同水平的影響由大到小為A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，最佳成型工藝為A2B2C2。以顆粒水分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的影響由大到小為A ＞B ＞C，顆粒含水量較低，因素A、因素B、因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響。故優(yōu)選流化床制粒工藝為A2B2C2，即噴霧速率為20 r/min，霧化壓力為0.14 MPa，物料溫度為55 ℃。

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果制得的顆粒色澤、大小均勻，外形圓整，表明該工藝穩(wěn)定可行。詳見(jiàn)表9。

表9 流化床制粒工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%）Tab.9 Results of the validation test of the fluidized bed granulation process（%）

3 討論

3.1 水提工藝研究

根據(jù)藥材性質(zhì)及保持傳統(tǒng)湯劑的有效成分，采用水煎煮提取的工藝［3］，同時(shí)用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝［4］，既保留原方的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，又能充分提取藥材的有效成分，與醫(yī)院制劑的配制情況相符。影響水提效果的主要因素有浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等［5-6］。前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥材浸泡與否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。

方中黃柏為君藥，黃柏具有抗炎［7］、抑菌［8］、滋腎陰［9］的作用，且鹽酸小檗堿為黃柏的主要有效成分［10-11］；干膏得率反映中藥各組分提取的程度。故本研究中以鹽酸小檗堿含量和干膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，考察水提工藝。

中藥制劑在提取過(guò)程中，是否會(huì)造成有效成分破壞而影響藥效，后續(xù)研究還需結(jié)合臨床療效觀察和藥效學(xué)考察，確定更加科學(xué)的提取工藝。

3.2 成型工藝研究

本研究中采用流化床制粒法制備抗早顆粒，流化床制粒是指提取物清膏不經(jīng)干燥直接霧化后噴灑輔料，工藝過(guò)程中混合、制粒、干燥一步完成，可減少輔料用量，縮短制粒時(shí)間，減少有效成分損失，更符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求［12］。

不同中藥浸膏的特點(diǎn)，流化床制粒工藝參數(shù)的影響因素不相同［13-14］。制粒過(guò)程中的主要影響因素包括浸膏相對(duì)密度、噴霧速度、霧化壓力、物料溫度、出風(fēng)口溫度等［15-16］。浸膏相對(duì)密度高，浸膏黏度大，易堵塞噴頭；相對(duì)密度太低制得的顆粒偏小，影響成品率。浸膏作為流化床制粒黏合劑，其噴霧速率是制粒成型的重要因素，噴霧速率越快，制得顆粒越大，但顆粒易黏結(jié)、塌床［17］；速率過(guò)慢耗時(shí)長(zhǎng)，顆粒細(xì)粉過(guò)多。霧化壓力也是制粒的重要影響因素，霧化壓力高，顆粒粒徑小，易干燥成粉末；壓力低則霧滴大，易結(jié)塊。物料溫度高，顆粒干燥速度快，易失去黏合作用，產(chǎn)生過(guò)多細(xì)粉；物料溫度低，顆粒來(lái)不及干燥，易黏結(jié)，甚至塌床［18］。

可見(jiàn)，不同工藝參數(shù)均影響顆粒得率和水分。故以顆粒得率、含水量為考察指標(biāo)。目前，正交試驗(yàn)是中藥顆粒劑成型工藝篩選的常用方法［19］。本研究中對(duì)浸膏相對(duì)密度、噴霧速率、霧化壓力、物料溫度進(jìn)行單因素考察，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以物料溫度、霧化壓力、噴霧速率為考察因素，同時(shí)以顆粒得率、含水量為考察指標(biāo)，優(yōu)選流化床制粒工藝。

3.3 方法評(píng)價(jià)

所優(yōu)選的抗早顆粒的水提工藝和流化床制粒工藝穩(wěn)定、可行，制得的顆粒溶化性好，大小適中，色澤均勻，可為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。