三黃跌打膏對急性軟組織損傷大鼠的療效及作用機制

姜新根 李若竹 胡蓮花

急性軟組織損傷多是由鈍性或銳性暴力損傷所致，使患區出現疼痛、腫脹、功能性障礙等異常表現[1]。西醫處理多進行肢體冷敷，口服或外敷消腫止痛藥物，但整體效果不佳[2]。中醫將急性軟組織損傷歸屬于“筋傷”范疇，可單獨出現，也可伴有骨折發生。目前，中醫藥對急性軟組織損傷的治療體現出無與倫比的優勢，尤其是外用藥膏，操作簡單，攜帶方便，且不良反應小，受到諸多醫學工作者的高度關注[3]。三黃跌打膏是由深圳市中醫師王進東主任憑借30多年臨床經驗所制作出的名方，具有活血化瘀、消腫止痛、清熱解毒功效[4]。雖為名方，在臨床有一定應用，但基礎研究甚少，尤其是具體機制，更是缺乏研究論證。故肯定了該研究的探索價值?，F本實驗通過建立急性軟組織損傷大鼠模型，探討三黃跌打膏的臨床治療效果及作用機制，為其在臨床應用奠定堅實的理論基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

64只SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體重220～240 g，平均（231.35±1.26）g；購于廣東斯嘉景達生物科技有限公司[SCXK（粵）2020-0052]。飼養環境：華南農業大學實驗動物中心屏障環境設施[SYXK（粵）2019-0136]，自由飲食、飲水，標準大鼠飼養適應性喂養，連續3 d，溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，晝夜交替時間各12 h。

1.2 儀器與試劑

JK-6型攤片機、JT-12J脫水機、JB-L5包埋機、JB-L5凍臺、JK-6組織攤片機均購于武漢俊杰電子有限公司，HI 1220型烘片機購于德國徠卡公司，LEiCA RM2016型病理切片機購于上海徠卡儀器有限公司，DGX-9003B型烤箱購于上海?，攲嶒瀮x器有限公司，AggRAM型血小板聚集儀購于北京中昊萬通科技有限公司，SA900型血流變分析儀購于賽科希德科技發展有限公司，Multiskan FC 型酶標儀購于Thermo Fisher公司。白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）定量分析酶聯免疫試劑盒，購自安徽巧伊生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE2）酶聯免疫試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備 三黃跌打膏：由大黃、黃連、黃柏、制天南星、赤小豆、樟腦組成，將大黃、黃連、黃柏、制天南星混合并研磨成粉末，過100目藥篩。用5倍量純凈水浸泡赤小豆，連續浸泡30 min，先用大火煮開，再用小火繼續煎煮30 min，然后收集煎煮藥液。剩下藥渣繼續用5倍量純凈水煎煮，煎煮過程同第一次煎煮過程，過濾藥液，混合第一次藥液，繼續煎煮藥液，使其濃縮成含生藥1 g/ml的濃縮液。樟腦用95%乙醇100 ml溶解，與含有赤小豆1 g/ml的濃縮液混勻，再取蜂蜜20 g溶至混合液內，攪拌均勻并調和大黃、黃連、黃柏、制天南星混合粉末，制成貼膏后置于4 ℃保存備用。

1.3.2 動物模型制備 64只大鼠適應性喂養3 d，其中16只大鼠繼續正常喂養，未建立模型。其他建立模型：在模型建立1 d，將大鼠左側臀部、大腿后側毛發剔除干凈，細小毛發用8%硫化鈉清除干凈。采用10%水合氯醛麻醉，采用200 g砝碼，從50 cm高度自由落體，連續擊打大鼠右后大腿肌肉豐厚部位，連續2次，使打擊部位出現散在出血、腫脹、皮下瘀斑，皮膚無破損，無骨質，單側肢體跛行，即造模成功。

1.3.3 分組及給藥 48只大鼠分為3組，每組16只，即模型對照組（未予以干預）、三黃跌打膏組、狗皮膏藥組。給藥組：在造模成功后1 h給予相應藥物包扎，以特制膠布及紗布固定，換藥1次/d，連續7 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 病理組織學檢查 在第3、7 d將取血后的大鼠采用牽引脫臼方法處死后，以打擊點為中心，分離皮下組織，切取直徑約為2 cm的肌肉，10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片厚4～5 μm，蘇木精—伊紅染色法（HE染色），顯微鏡下觀察充血、出血、變性組織壞死、炎癥細胞浸潤，分別計0～3分。充血、出血：0分：無；1分：少量；2分：較多血管充血；3分：血管大片充血或灶性出血。變性壞死：0分：無；1分：局部組織變性；2分：廣泛性組織變性；3分：大片組織變性。炎癥細胞浸潤：0分：無；1分：少量、散在的炎癥細胞浸潤；2分：較多、片狀炎癥細胞浸潤；3分：大量、彌漫性炎癥細胞浸潤。

1.4.2 氧化應激反應 在第3、7 d給藥后2 h，經腹腔注射3%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，經腹主動脈采集血液5 ml，采用酶聯免疫吸附試驗法測定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）。

1.4.3 炎癥介質檢測 采血方法同氧化應激反應的采血方法，室溫靜置2 h，離心5 min，3 000 r/min，采用酶聯免疫吸附試驗法測定IL-1β、TNF-α、PGE2水平，嚴格按照說明書操作。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，涉及多組間數據比較用重復方差F檢驗，兩組間數據采用t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理損傷表現

正常對照組：肢體肌肉組織整體結構正常，肌纖維排列整齊、形態規則，無肌纖維核中移，無變性壞死，無炎癥細胞浸潤。模型對照組：造模3 d后，肌肉組織內肌細胞變性壞死，血管出血，間質內有大量炎癥細胞浸潤；造模7 d，肌細胞變性，血管出血，間質內炎癥細胞浸潤。三黃跌打膏組：給藥3 d，肌肉組織整體結構正常，組織內少量炎癥細胞浸潤，組織肌纖維排列紊亂，部分肌纖維核中移，細胞核呈圓形，組織較多壞死；給藥7 d，肌肉組織結構、肌纖維排列及形態基本正常，無肌纖維核中移、無壞死，組織內無明顯炎癥細胞浸潤。狗皮膏藥組：給藥3 d，肌肉組織整體結構正常，組織內少量炎癥細胞浸潤，組織肌纖維排列紊亂；給藥7 d，組織大量肌纖維崩解壞死，壞死區大量炎癥細胞浸潤，血管充血擴張。見圖1。

圖1 HE染色結果

2.2 病理組織評分

與正常對照組比較，模型對照組病理評分增加，給藥組病理評分均低于模型對照組，以三黃跌倒膏組病理評分降低最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠病理組織評分比較(分,±s)

表1 4組大鼠病理組織評分比較(分,±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與狗皮膏藥組比較，cP＜0.05

組別 例數 病理評分 正常對照組 16 0 模型對照組 3 d 8 5.85±1.08a 7 d 8 7.28±1.10a 狗皮膏藥組 3 d 8 3.76±0.68ab 7 d 8 2.48±0.63ab 三黃跌倒膏組 3 d 8 2.84±0.73abc 7 d 8 1.63±0.62abc

2.3 氧化應激反應

與正常對照組比較，模型對照組氧化應激反應指標明顯改變，與模型對照組比較，給藥組氧化應激反應指標均有所改善，且以三黃跌打膏組改善最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠氧化應激反應指標比較(±s)

表2 4組大鼠氧化應激反應指標比較(±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與狗皮膏藥組比較，cP＜0.05

組別 例數 SOD(U/ml) MDA(μmol/L) NO(μmol/L)正常對照組 16 54.40±2.51 3.12±1.05 9.21±1.18 模型對照組 3 d 8 40.86±1.90a 6.98±1.08a 16.38±1.21a 7 d 8 42.46±1.96a 7.15±1.12a 15.51±1.28a狗皮膏藥組 3 d 8 47.20±1.32ab 5.55±1.04ab 13.35±1.18ab 7 d 8 50.86±1.35ab 6.06±1.06ab 12.42±1.21ab三黃跌打膏組 3 d 8 50.12±1.36abc 4.16±1.02abc 11.30±1.20abc 7 d 8 54.78±1.40abc 4.21±1.03abc 10.38±1.25abc

2.4 炎癥介質水平

與正常對照組比較，模型對照組炎癥介質水平有所提高，給藥組炎癥介質水平均有所降低，且以三黃跌打膏組降低最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠炎癥介質水平比較(ng/L,±s)

表3 4組大鼠炎癥介質水平比較(ng/L,±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與狗皮膏藥組比較，cP＜0.05

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3 討論

急性軟組織損傷主要是因外力作用導致，其病理表現以外傷性無菌性炎癥反應為主，病理可見局部組織變性壞死、血管擴張充血出血、炎癥細胞浸潤、組織水腫等。本研究在建立大鼠模型后，肌細胞變性，肌肉中血管出血，間質內大量炎癥細胞浸潤。故相應驗證了急性軟組織損傷的病理表現。中醫學認為急性軟組織損傷病機為氣滯血瘀、血溢脈外、脈絡不通所致，故在治療時宜活血化瘀、通絡止痛[5]。因此研究采用三黃跌打膏，大黃有活血化瘀、涼血散熱、通經通絡之功；黃連、黃柏有清熱除濕、瀉火解毒之功；制天南星有清熱除濕、祛風散痰、散結消腫之功；赤小豆有利水消腫、解毒排膿之功；樟腦有行氣化瘀、消腫止痛之功。諸藥配伍可發揮活血祛瘀、通經止痛、消腫散結的功效，對軟組織損傷有確切的治療作用。本研究中，三黃跌打膏組、狗皮膏藥組病理評分低于模型對照組，且三黃跌打膏組病理評分最低。說明膏藥外敷可有效治療急性軟組織損傷，其中以三黃跌打膏治療效果最顯著。

現代醫學認為急性軟組織損傷后，免疫系統會在短時間內做出一過性的促炎與抑制炎癥反應，大量炎癥介質釋放，故抑制炎癥反應對改善急性軟組織損傷有重要意義。同時大量致痛性炎癥介質的釋放，可直接導致疼痛，炎癥局部腫脹會壓迫神經末梢，也可引起疼痛[6]。另外炎癥介質會增加靜脈通透性，促使血管收縮，加重肢體缺氧缺血，影響血液流變學，增加血漿黏度，引起肢體腫脹[7]。同時氧自由基是炎癥反應發生過程中的重要因子，具有強烈的趨化作用，可加重機體炎癥反應。此時通過抑制氧自由基的合成及釋放，可延緩炎癥反應的進展，減輕炎癥程度。本研究中，在大鼠模型建立后，大鼠血清炎癥介質水平及氧化應激反應指標較正常對照組明顯改變，但在給藥后各血清因子有所改善，其中三黃跌打膏組血清IL-1β、TNF-α、PEG2、MDA、NO水平低于狗皮膏藥組，SOD高于狗皮膏藥組。表明當大鼠發生急性軟組織損傷后，伴隨明顯炎癥反應，血漿黏度增加，而及時給藥，可顯著改善肢體血液循環，減輕機體炎癥反應，減弱氧化應激反應，其中三黃跌打膏作用最明顯。IL-1β是促進炎癥反應發生的重要介質，當機體組織受損后，IL-1β水平升高，并會誘導白細胞介素-6（IL-6）等其他促炎物質的釋放，誘發炎性疼痛，形成瀑布式炎癥級聯反應；TNF-α是反映機體炎癥反應的重要因子；PGE2是反映炎性疼痛的重要物質，當機體炎性疼痛加劇，PGE2水平明顯升高[8]。SOD是清除超氧陰離子自由基的重要酶，是維持機體氧化及抗氧化平衡的重要因子；MDA是體內脂質過氧化的最終產物，可間接反映細胞損傷程度；NO是促使炎癥病理進展的重要物質，并可與氧自由基等物質反應生成一種氮氧化合物，不斷釋放細胞毒素，造成細胞損傷。此時采用三黃跌打膏，大黃、黃連、黃柏起到抗炎、抗菌、減輕組織腫脹的作用，可有效抑制損傷組織的炎癥反應，降低毛細血管通透性，抑制氧自由基的釋放，快速減輕受損軟組織的腫脹、疼痛程度[9-11]。

綜上所述，三黃跌打膏對急性軟組織損傷大鼠有顯著效果，該作用可能是通過抑制氧自由基的生成，降低炎癥介質水平改善急性軟組織損傷程度。但該研究尚有不足，對三黃跌打膏的作用探討僅為初步探索，由于炎癥介質調控通路錯綜復雜，相互影響、相互制約，未探討三黃跌打膏是通過何種通路發揮抗炎作用；而且本實驗未能回答三黃跌打膏對大鼠免疫功能的影響及最優使用量、軟組織損傷的免疫抑制作用，值得后續研究進一步論證。