Wnt/β-catenin信號通路與帕金森病的研究進展

孫 雪， 李金田， 金 華綜述， 梁建慶，2審校

帕金森病(Parkinson’s disease，PD) 是神經系統退行性疾病，臨床以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態異常等運動障礙為主要表現。患者發病年齡多大于60歲，≥65歲老年人患病率約為 1.7%[1，2]。研究表明中腦黑質致密區多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性缺失和路易小體(Lewis Body，LB)形成是誘導PD發生的重要病機[3]，最終導致膽堿能系統功能相對亢進，造成PD患者出現運動功能障礙及認知和心理等其他非運動癥狀。PD發病機制迄今尚未完全闡明。

Wnt是參與動物發育的重要信號分子，在器官發育、細胞增殖、分化凋亡、神經發生和干細胞維持等方面都發揮了重要的調節作用[4～6]。Wnt信號通路中以經典的Wnt/β-連環蛋白信號通路(canonical Wnt/β-catenin)作用最為廣泛，其與多種神經系統疾病的發生和發展有關[7]。Wnt/β-catenin 信號通路的異常與PD的發生密切相關[8]，現對 Wnt/β-catenin 信號通路與PD發病、相關分子表達等研究進展進行綜述。

1 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt/β-catenin信號通路是一條在進化中高度保守的信號通路。Wnt信號依據轉導方式的不同分為3種通路：經典的Wnt(canonical Wnt /β-catenin)信號通路、Wnt-PCP(Wnt-planar cell polarity)信號通路、Wnt-Ca2+信號通路，其分別負責激活細胞核內的特定基因、調控細胞骨架的重排、刺激細胞內鈣離子的釋放。研究發現，經典Wnt/β-catenin信號通路在調控中樞神經系統(central nervous system，CNS)方面發揮重要作用，與神經退行性疾病PD相關聯[9，10]。Wnt/β-catenin通路主要通過細胞外因子wnt家族分泌蛋白、特異性跨膜受體卷曲蛋白(Frizzlled，Fzd)、散亂蛋白(scaffolding protein dishevelled，Dvl 或Dsh)、β-連環蛋白(β-catenin)、結腸腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatouspolyposiscoli，APC)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、軸蛋白或傳導蛋白(Axin或Conductin)及T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer-binding factor，LEF)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related protein5/6，LRP-5/6)等激活靶基因表達。經典Wnt/β-catenin 信號通路的激活以β-catenin為核心，啟動因子是Wnt蛋白。

當Wnt蛋白缺失時，Wnt/β-catenin途徑無法被激活。胞內的GSK-3β、APC蛋白、Axin及CK1組成破壞復合物，介導β-catenin的磷酸化。隨后磷酸化的β-catenin被泛素介導的蛋白酶體識別并降解，細胞內的β-catenin處于低水平無法轉移到細胞核中，下游基因的表達被抑制，Wnt/β-catenin途徑中斷[11]。

當Wnt蛋白存在時，Wnt/β-catenin途徑被激活。Wnt與其主要受體Frizzled及低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)結合，激活胞內的Dsh蛋白，釋放GSK-3β，導致 APC/Axin/GSK-3β/CK1復合體解離，β-catenin 的磷酸化被抑制而免于降解[12]。隨后穩定積累的β-catenin進入細胞核中，與轉錄因子TCF/ LEF結合募集一系列共激活因子，激活下游靶基因的轉錄，誘導染色質結構變化，促進細胞的增殖與分化。Wnt信號通路的激活和失活過程見圖1[13]。

圖1 Wnt信號通路圖(引自Wisniewska MB，2013)

2 Wnt/β-catenin信號通路與PD

Wnt/β-catenin 信號通路具有調節細胞分化及增殖等功能，能夠促進DA能神經元新生、細胞存活以及突觸發生，是促進神經再生修復的重要信號通路之一。不同的PD模型中均發現Wnt信號的受損或者被抑制。L’Episcopo[14]等運用神經干/祖細胞(mNPCs)體外培養以及對基因小鼠MPTP(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyri-dine)模型的體內研究，證實衰老抑制了Wnt信號轉導，而β-catenin的特異性GSK-3β拮抗劑在原位激活促進了與運動功能障礙逆轉相關的DA能神經修復。L’Episcopo等[15]還利用MPTP誘導的PD動物模型發現，黑質紋狀體中DA能神經元功能的喪失與恢復和Wnt/β-catenin通路的激活相關。Singh[16]等證實Axin-2 / Wnt /β-catenin信號傳導在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的PD大鼠模型中改善了其行為學功能并通過增加PD大鼠的線粒體功能來保護黑質DA能神經元。Mishra等[17]研究結果表明，DA受體通過激活PD大鼠模型中的Wnt /β-catenin信號傳導來調節DA能神經發生和線粒體功能。MPTP誘導的PD模型中，神經元凋亡與低水平的β-catenin以及高活性的GSK3β相關，通過藥物提高β-catenin 蛋白水平激活 Wnt/β-catenin 信號通路對PD模型具有神經保護作用[18]。

相關實驗還發現，姜黃素可激活Wnt/β-catenin信號通路，增強Wnt3a、β-catenin蛋白表達，發揮神經保護作用[19，20]。肉蓯蓉能改善6-OHDA顱內注射建立的PD大鼠的行為障礙，通過抑制GSK-3β、p-β-catenin蛋白的活性，增加β-catenin蛋白表達，激活Wnt信號通路，從而保護DA神經元[21]。紅景天通過Wnt/β-catenin信號通路，保護神經元免受缺血性損傷[22]，以及調節骨髓充質干細胞向神經細胞的定向分化[23]。滕龍等[24]實驗表明復方地黃顆粒(由熟地黃、珍珠母、炒丹參等組成)能通過調控GSK3β信號通路，影響細胞凋亡，達到改善PD癥狀。

上述研究結果都表明Wnt/β-catenin信號途徑與DA能神經元存活、突觸發生密切相關，在PD的發生發展中發揮重要作用。

3 Wnt/β-catenin信號通路在PD中相關分子的表達

Wnt/β-catenin信號通路作為一條多環節、多作用靶點、復雜的蛋白質作用網絡，參與了神經發生的生理過程，而異常的Wnt信號通路參與PD發生發展的病理過程。進一步了解Wnt信號通路配體、受體和共受體間的多種潛在作用方式，確定其內部組分的功能對于PD的治療靶點至關重要。Wnt/β-catenin信號通路相關分子龐大，種類豐富，其基本特性也各有千秋。近年來的研究發現Wnt1、LRP6、β-catenin、GSK3β、Fzd與PD 的關系密切。現針對上述重要信號分子在PD中發揮的作用進行一一闡述。

3.1 Wnt1 Wnt蛋白由350～400個氨基酸組成，其羧基末端含有23或24個保守的半胱氨酸殘基Wnt1屬于細胞外因子Wnt家族分泌蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路中的配體蛋白。同時，Wnt1也是Wnt/β-catenin信號通路的啟動蛋白，可與受體結合激活通路。Wurst等[25]研究表明Wnt1是調節中腦DA前體細胞增殖分化的重要分子，Wnt1缺失會使中腦發育紊亂。Andersson等[26]研究表明Wnt1協調DA規范和體內神經發生，通過基因相互作用與Wnt5a共同促進體內中腦DA神經元的發育。Wnt1是DA能神經元發育的關鍵調控因子[27]。Wnt1涉及的神經保護作用主要分為兩個方面。一方面是直接作用：Wnt1由星形膠質細胞分泌，與卷曲受體Fz結合，并對DA能神經元產生直接的保護作用[28]。另一方面是間接作用：Wnt1也可能通過自分泌作用與星形膠質細胞上的受體結合，并調節星形膠質細胞對DA能神經元的保護作用。Wnt1是富含半胱氨酸的糖基化蛋白，可促進神經元細胞和星形膠質細胞的串擾，從而在PD模型中發揮神經保護作用[29]。谷氨酸的興奮性毒性被認為是PD的發病機理[30]，星形細胞是大腦中Wnt信號的重要來源。研究證實，Wnt1能促進興奮性氨基酸轉運蛋白EAAT2(可清除過量谷氨酸)在星形細胞中的表達，并介導星形膠質細胞對DA能細胞的保護作用[31]。目前研究表明，Wnt1在PD中有著不可或缺的調控作用，Wnt1的存在確保中腦有適當的神經發生，DA代謝功能的獲得以及神經元的存活[32]。

綜上，Wnt1在Wnt/β-catenin信號通路中作為啟動因子，通過直接或間接方式保護DA能神經元，以達到改善PD癥狀的目的。

3.2 LRP6 低密度脂蛋白受體(LDLR)相關蛋白6(LRP6)是一個單一的跨膜蛋白，與LRP5用于引導Wnt /β-catenin的正常激活及反應，在PD的病理過程中發揮重要作用。LRP6在Wnt /β-catenin信號通路中被磷酸化，磷酸化的LRP6與GSK3β結合直接抑制β-catenin磷酸化，確保β-catenin穩定易位至核以調節Wnt靶基因表達的穩定[33，34]。LRP6是腹中腦(VM)和正常VM形態發生中DA分化所必需的，在DA神經元發育的早期階段的分化中具有作用[35]。Branco等[35]通過LRP6突變小鼠實驗，在胚胎第(E)11.5 d觀察到了TH陽性神經元數量的明顯減少，中腦形態發生的缺陷，DA前體分化的發作有所延遲。LRP6介導的Wnt /β-catenin信號通路對神經元突觸完整性和神經元活性具有至關重要的作用[36]。

目前，對于LRP6通過Wnt /β-catenin信號通路與PD相關性的報道較少，但就已報道研究可見LRP6在Wnt /β-catenin信號通路中必不可少的作用以及對中腦發育的影響，我們有理由認為其與PD密切相關。

3.3 β-catenin β-連環蛋白(β-catenin)是Wnt /β-catenin信號通路的主要成分，起著細胞黏附的作用，在大腦的發育、功能維持和病理情況下都有著重要的作用。Zhao等[37]在細胞水平證實β-catenin是調控DA能神經發生的關鍵分子，它通過維持神經微環境的完整性和神經前體細胞向DA能神經元的發育進程來調控DA能神經元的發生。基因和胚胎的研究發現，β-catenin是通過從細胞質轉入細胞核中進行信號傳導[38]。經典Wnt途徑被激活后，β-catenin得以進入細胞核積累，與轉錄因子結合使基因表達。β-catenin增高并發生的核轉位可以促進細胞內基因的激活，這種激活有促進凋亡和抑制凋亡兩方面的作用[39，40]。孫欣等[41]采用MPTP亞急性方法處構建PD小鼠模型，研究發現，PD模型中β-catenin在腹側中腦的表達增加了，且β-catenin發生了核轉移，證實β-catenin與神經退行性變的過程有關聯。Zhao等[42]通過研究表明，β-catenin的缺乏導致黑質DA能神經元基礎水平的氧化應激升高，并進一步加強了百草枯(PQ)誘導的黑質和紋狀體軸突終末TH+神經元的氧化損傷和丟失，表現為加劇了PD運動障礙。β-catenin的穩定恢復了黑質紋狀體的可塑性和運動協調性，而DA神經元中β-catenin的消融改變了運動障礙，并影響紋狀體mRNA水平，影響了一些已知調節突觸可塑性和DA神經傳遞的標志物[43，14]。

綜上，β-catenin作為Wnt /β-catenin信號通路的主要成分，通過調控DA能神經元的發生達到改善PD運動障礙的目的。

3.4 GSK3β 糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是一種多功能的絲氨酸/酪氨酸，其活化與神經元凋亡的增加直接相關，在PD的相關研究中認為其可以作為治療靶點。Nagao等[44]運用免疫組織化學方法檢測了GSK-3β在PD患者腦組織中的表達，證實GSK-3β與LB中a-突觸核蛋白(a-synuclein)的表達密切相關。在Wnt /β-catenin信號通路中，GSK3β蛋白的表達被抑制或減弱，則無法形成破壞復合物，從而無法介導β-catenin磷酸化，游離的β-catenin轉移進核內與結合蛋白一起觸發下游靶基因的轉錄，促進細胞的增殖與分化。體內病理性a-synuclein聚集及自噬功能失衡將引起DA能神經元的退行性病變，出現PD。李芳毅等[45]研究發現GSK-3β可上調自噬水平，間接影響細胞對a-synuclein的降解能力，從而起到保護神經細胞的作用。GSK-3β失調有利于PD病理發生過程中特定區域的磷酸化及Tau和a-synuclein(PD發生中最重要的兩基因)的積累[46]。研究表明，GSK-3β的抑制減少了由MPTP毒性誘導DA能神經元損傷[47，48]，暗示GSK-3β與PD發病機制有關。Chen等[49]實驗表明GSK-3β是與神經退行性疾病相關的促凋亡信號級聯反應中的關鍵中間體，介導6-OHDA誘導的神經元死亡。GSK-3β通過調節多種信號通路來影響PD發病機制中涉及DA能神經元變性等病理事件，包括線粒體功能障礙，氧化應激，蛋白質聚集和炎癥反應[50～54]，最終確保DA能神經元的存活，阻斷與PD發病機理有關的致病途徑。

綜上，眾多研究表明，GSK-3β的表達被抑制可以保護DA能神經元免受各種應激誘導的損傷，證實GSK-3β與PD發病機制的關聯性。

3.5 Fzd Wnt受體特異性跨膜受體卷曲蛋白(Frizzlled，Fzd)為7次跨膜蛋白，結構類似于G蛋白偶聯型受體，Fzd胞外N端具有富含半胱氨酸的結構域(cysteine rich domain，CRD)，該結構域由120至125個殘基組成，具有10個保守的半胱氨酸，是Wnt分子結合所必需的[55]。研究證實，成熟的中腦表達DAT的神經元包含大多數Fzds，其中經典的Wnt受體Fzd-1最豐富[28]。Fzd-1受體是中腦DA神經元的下游促存活效應子，與Wnt1共同參與星形膠質細胞神經保護作用。

目前，Fzd蛋白家族在Wnt /β-catenin信號通路中針對PD發揮的作用研究不夠透徹，相關報道較少，但其作為配體是激活通路中必不可少的蛋白。

4 研究Wnt /β-catenin信號通路在PD治療中的意義

4.1 PD目前治療的局限性 現今，口服補充患者腦中DA的藥物是PD的首選治療方法，但藥物長期使用會導致療效降低，運動障礙等后期并發癥，嚴重影響患者生活質量。此外，手術治療、中醫治療、照料護理也在PD的治療中有一定的作用。但這些治療措施只能暫時緩解患者的癥狀，并不能阻止DA能神經元的進行性丟失，最終仍是無法控制PD的發展。臨床PD的針對性治療還有待突破。

4.2 探索Wnt /β-catenin信號通路的意義 PD的發病機制尚不清楚，黑質紋狀體的DA能神經元發生退行性變是導致其發生的主要病理特征。尚認為此系統存在一定的可塑性，因其黑質的DA能神經元減少是發生在臨床癥狀出現之前，若能對DA能神經元進行調控，可改善臨床癥狀。近年來，經過科研人員的深入研究，發現Wnt/β-catenin 信號通路具有調節細胞分化及增殖等功能，能夠促進DA能神經元新生、細胞存活以及突觸發生，是促進神經再生修復的重要信號通路之一[56]。課題組前期研究發現，復方地黃顆粒可能通過調控PD大鼠腦組織右側紋狀體Wnt/β-catenin信號通路起到保護DA能神經元的作用[57]。這一發現有望成為PD治療瓶頸的新突破。進一步探索Wnt信號通路配體、受體、共受體等之間的多種作用方式，以及Wnt信號通路激活或抑制狀態下各種指標的動態演變，對于PD發病機制研究至關重要，同時也可闡明藥物治療PD的作用靶點，為再生以及轉化醫學的發展提供新的思路和線索。