環氧二十碳三烯酸對缺血性腦卒中的多靶點作用

聶 歡綜述， 劉文娟審校

腦卒中與缺血性心臟病、惡性腫瘤已經構成了大多數國家的三大致死疾病。腦卒中分為了出血性卒中與缺血性卒中，具有發病率高、致殘率高及死亡率高的特點。本病的發病特點無論是給家庭還是社會都帶來了巨大的負擔。因此對缺血性卒中的發病機制及治療一直是臨床醫學研究的重點。近年來，靶向治療一直是備受關注，缺血性腦血管疾病本就是一個復雜的過程，環氧二十碳三烯酸(epoxy eicosatrienoic acid，EET)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)經細胞色素 P450 酶途徑生成的，可形成四個區域異構體：5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET和14，15-EET，EET自1980年代初期在肝臟中首次發現以來，受到越來越多的關注，目前已經在包括心臟、肺、胃腸道、腎臟以及腦在內的不同組織中研究了EET的不同功能。EET主要在神經元胞體中檢測到，其表達向下延伸至人額葉皮質、海馬、基底神經節、杏仁核和小腦的軸突和樹突[1]。EET在腦中已被證明有擴張腦血管、調節腦血流量、抗炎、抗凋亡、抗氧化以及直接的保護神經細胞，新型膠質細胞以及內皮細胞的作用。這種對血管、神經、內皮細胞以及星形膠質細胞的多重保護作用，有望成為腦梗死后治療的新物質。

1 EET對組織缺血缺氧的保護作用

EET能夠減輕組織的缺血再灌注損傷，其在腦、心臟、肺組織中都對缺血再灌注損傷具有保護作用，CYP2J2過表達可以減輕腦組織以及心肌組織的缺血再灌注損傷。在內皮特異性過表達人CYP2J2的小鼠中，于缺血再灌注后與野生型小鼠對比，損傷體積明顯減小[2]。并且在缺血或者缺氧條件下，EET的產生都會增加這就提示EET可以作為抗缺血性腦損傷的內源性神經保護劑。在腦組織中EET已被證明具有抗炎、抗凋亡、促血管生成和血管舒張作用，并且可以抑制新型膠質細胞聚集、瘢痕形成、小膠質細胞激活、神經元凋亡從而減小腦梗死面積[3，4]。那么EET具體如何發揮腦保護的作用，也是近年來各個學者研究的熱點。

1.1 EET對腦血管及腦血流的作用 EET對血管的舒張作用已經在腦血管、冠狀動脈、腎臟、骨骼肌、頸動脈、腸系膜動脈中被證明。近年來CYP450衍生的EET被認為是血管功能和腦血管血流的新型介體。在大腦中，EET的釋放有助于改善腦血流并且其在調節腦血流量中的作用超出了在外周循環中擴血管的作用。除內皮細胞和神經元外，星形膠質細胞也可以產生EET，星形膠質細胞是腦內神經-血管偶聯的重要物質，它將神經系統突觸和周圍的微循環連接起來。它是通過刺激代謝型谷氨酸受體(mGluRs)來感知神經元的活動，從而釋放P450類花生酸來擴張鄰近小動脈并增加血流，EET和mGluR對急性缺氧時的腦血流量(CBF)有顯著增加作用，mGluR可能在信號級聯的上游起作用[5]。血管舒張的機制為何，研究發現 EET一方面促進星形膠質細胞KCa通道的開放，產生足夠的K+，使血管平滑肌內向整流K+通道開放，導致腦小動脈超極化和血管擴張。另一方面，EET以旁分泌方式直接打開腦血管平滑肌細胞的KCa通道，導致腦小動脈的超極化和擴張[6]。Earley等也研究表明，11，12-EET刺激腦動脈平滑肌細胞瞬時受體電位香草酸亞型4(TRPV4)誘導超極化，增加Ca2+的釋放促進血管舒張[7，8]。

EET除了對大腦動脈有舒張的作用，還會對腦循環產生非血管舒縮作用。星形膠質細胞衍生的EET在體外與體內都有促進血管生成的作用。在各種體外和體內模型中，外源性給藥 EET 已被證明可誘導內皮細胞增殖和血管生成[9，10]。腦微血管內皮細胞在皮質星形膠質細胞共培養或暴露于星形膠質細胞條件培養基時，會出現增殖并表現出自發的管狀結構形成。有研究發現14，15-EET顯著增加了vWF和CD34陽性血管數量，從而證明了CYP-EET信號可以促進缺血后的血管生成[11]。這種活性的機制與 PI3K/Akt 和 MAPK信號轉導級聯中的蛋白質激活以及增加血管生成的生長因子表達有關[12]。也有研究在腫瘤模型中表明 8，9-EET 刺激的血管生成可以通過COX-2 代謝生成的11-羥基-8，9-EET(8，9，11-EHET)而增強，這種作用可能是通過血管內皮生長因子受體(VEGRF)信號通路介導[13]。雖然 EET 激活了幾種不同的血管生成信號級聯，但最近的證據表明，EET 血管生成活性可能進一步依賴于由環氧合酶 (COX) 形成的下游代謝物。

EET被多種細胞釋放，通過對腦血管的擴張，增加腦血流量以及增加血腦血管生成對腦組織產生多方面的保護作用。目前的研究表明舒張血管作用與激活血管平滑肌肌膜上離子通道開放有關。血管生成作用可能歸因于諸如絲裂原活化蛋白激酶等信號通路有關。

1.2 EET對神經血管單位的保護作用 與外周不同的是，EET除了對血管的作用外，還作用于中樞神經系統特有的細胞，是中樞神經系統細胞間的關鍵整合者，可以協調不同細胞間的應答。在腦缺血的環境下，EET生成會增加，并且就通過保護內皮細胞、神經膠質細胞和神經元從而保持神經系統所必須的細胞網絡。EET對神經血管單位的幾個組成部分：神經元、星形膠質細胞和血管內皮可以產生直接并且獨立于血流的細胞保護作用。

EET對血管內皮的作用進行了廣泛的探索。在腦血管中，內皮細胞的穩定性是腦缺血再灌注后恢復情況的一個重要因素。14，15-EET保護了雄性和雌性內皮細胞免受氧-葡萄糖剝奪(OGD)誘導細胞死亡[14]。在膿毒癥小鼠模型中，EET通過減少GRP78-Src相互作用降低Src活化，隨后抑制活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成、Rho-ROCK活化，有助于降低人血管內皮鈣黏蛋白和肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而增加血管的穩定性[15]。同樣的，EET對神經元的保護作用也是受到了重視，直接給予EET也可以以非血流依賴的方式保護神經元免受OGD和氧化應激誘發的細胞死亡，增加了神經元的存活率。14，15-EET促進了皮質神經元的軸突生長[16]也促進了原代培養的大鼠海馬神經元突起的生長。這可能是通過產生鈣內流從而有助于神經突起生長，并且這種作用可能與TRPV4通道有關[17]。但由于14，15-EET可以激活多種離子通道，包括鈣激活鉀通道和電壓門控鈣通道，由于在在實驗中有沒探討其他離子通道，所以也不排除14，15-EET在這些離子通道上引起鈣內流。星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的膠質細胞群，是神經血管單位的重要組成成分[18]。將 EET 應用于培養的星形膠質細胞可提高 OGD 的存活率[2，19]并保護星形膠質細胞線粒體免受 β-淀粉樣蛋白毒性[20]。星形膠質細胞可以產生很多神經營養因子，包括NGF、GDNF、BDNF、NT-3、NT-4/5等，在神經保護中起著重要的作用。研究表明14，15-EET通過BDNF-TrkB-Erk1/2信號通路提高星形膠質細胞的活力，保護神經元免受OGD/R損傷。這證實了14，15-EET介導的星形膠質細胞源性BDNF的產生對于增強星形膠質細胞的活力和保護神經元免受缺血損傷的重要性[19，21]。

EET對神經膠質細胞、內皮細胞、神經元的保護作用，也反過來增加細胞生成EET，產生良性循環。EET在局灶性腦缺血后可發揮多靶點保護作用，包括抑制炎癥因子，減少神經元凋亡，抑制星形膠質細胞增生和小膠質細胞活化，促進血管生成。雖然需要進一步的研究來揭示EET的下游靶點和機制，但CYP-EET信號可能是治療缺血性卒中的一個有希望的治療靶點[11]。

1.3 EET的抗炎作用 在腦梗死后，炎癥反應可以進一步加重腦損傷，并且腦梗死后的炎癥反應治療時間窗大于原發性缺血性損傷，那么對于大多數超時間窗的腦梗死患者來說，抑制腦梗死后的炎癥反應對其是十分必要的，所以也有大量實驗證明EET具有抗炎作用。產生EET的內皮CYP酶的過度表達限制了MCAO后的炎癥反應[22]。磷脂酶A2(PLA2)、環氧合酶-2(COX2)和前列腺素E2(PGE2)被認為是中樞神經系統重要的炎癥標志物。11，12-EET可降低腦缺血再灌注后SD大鼠腦內PLA2、COX2和PGE2的蛋白表達水平，并改善神經炎癥、腦梗死體積和腦水腫[23]。EET的抗炎基因組作用包括部分抑制IκB激酶及隨后的NFκB活化和炎癥信號傳導，包括抑制內皮細胞上促炎細胞因子和粘附分子的表達。其還激活核紅細胞相關因子-2(Nrf2)，誘導抗氧化蛋白和酶的表達。在細胞水平上，它通過調節內質網應激反應和維持線粒體功能來維持內質網線粒體內穩態和限制活性氧形成[24]。STAT1/3 信號是參與小膠質細胞誘導炎癥的其他重要途徑。外源性 EET 給藥抑制了體外STAT 3 的激活[25]。此外，EET可以抑制局灶性缺血后小膠質細胞的活化，減小腦梗死面積。也已被公認為在多種情況下具有抗炎特性，例如脂多糖誘導的炎癥[26]。

1.4 EET的抗凋亡作用 PI3K/AKT是一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路，參與細胞生長、增殖和分化，尤其是缺氧-缺血和再灌注期間的細胞凋亡[27，28]。大量實驗證明EET還可以通過PI3K/AKT途徑發揮抗凋亡作用。外源性EET和CYP2J2過表達增強了PI3K/AKT通道的激活，并且增加了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的水平，減弱了促凋亡蛋白Bax的表達和caspase-3的升高從而使得小鼠全腦缺血模型中細胞凋亡數減少[2]。14，15-EET 也可以通過調節 PI3K/AKT/CREB/Bcl-2 信號通路來抑制缺血再灌注過程中的線粒體凋亡。在內皮細胞過度表達CYP2J2基因(Tie2-CYP2J2-Tr)的轉基因小鼠中，14，15-EET水平升高，Tie2-CYP2J2-Tr小鼠雙側頸總動脈閉塞后，局部腦血流量(rCBF)和微血管密度顯著增加，ROS生成減少，腦梗死面積和神經元凋亡減少。實驗證明了PI3K/AKT通路的激活發揮了神經保護作用[29]。腦平滑肌細胞(CSMCs)是腦缺血再灌注過程中神經血管單位的組成部分，在神經元損傷中起重要作用。14，15-EET通過體外的JNK/c-Jun和mTOR信號通路，在OGD/R條件下減弱CSMCs中的氧自由基水平并抑制CSMCs的凋亡[30]。一項研究中認為PI3K/AKT的激活與KATP的上調有關，上調了其亞型Kir6.1 和 SUR2B 的表達[31]。在體外，PI3K/AKT途徑和KATP通道都介導了14，15-EET對OGD誘導的腦微血管SMCs凋亡的保護作用。14，15-EET還可以通過激活星形膠質細胞中的PPAR-γ/p-CREB信號通路促進BDNF的合成和分泌，從而減少神經元凋亡[19]。

2 小結及展望

EET對腦缺血有著多靶點，多機制作用。除以上之外EET還被證明有調節血小板聚集的作用，但其具體機制還需要進一步研究。綜上所述，在腦缺血的初期，EET的抗血栓和血管活性作用有助于維持局部和側枝血流，同時減少細胞凋亡，抑制炎癥因子。在缺血再灌注時期，其也發揮著重要抗炎和抗凋亡作用，在恢復期，還具有促進血管生成的作用，有助于腦梗死的后期康復。而目前實驗證明，EET在體內直接給藥會被很快代謝掉，并且EET的化學結構也不穩定。可溶性環氧化物水解酶(sEH)是EET內源性代謝的主要途徑。因此抑制sEH有望增強EET對缺血性腦血管疾病的保護作用。再者可以通過口服EET的類似物增加外源性EET，EET-A就是一個穩定的EET類似物，并且具有良好的生物學活性。EET對腦組織的保護作用貫穿了腦梗死的整個演變過程，其有望成為腦梗死治療中的一個具有前景的藥物。