結直腸癌患者血清外泌體整合素的表達及其臨床意義

焦蕉，唐繼云，劉佳琴，唐麒，李東芳，胡廣生，蔣益蘭*

1湖南省腫瘤醫院中西醫結合科，長沙 410013；2湖南中醫藥大學研究生院，長沙 410208；3衡陽市中醫醫院腫瘤科，湖南衡陽 421000；4湖南省中醫藥研究院附屬醫院中醫腫瘤學湖南省重點實驗室，長沙 410006

結直腸癌是全球癌癥發病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤[1]，嚴重影響人們的生命健康，臨床治療常采用手術、放化療、靶向治療、免疫及中醫中藥治療為一體的綜合治療模式。腫瘤轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因[2]，肝臟是結直腸癌轉移發生率最高的器官，而晚期結直腸癌5年生存率約11.7%[3-5]。因此，深入探討結直腸癌肝轉移的機制具有十分重要的意義。整合素屬于細胞表面黏附分子家族，通過與相應配體結合，介導細胞與細胞間及細胞與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的黏附反應，調控細胞的生物學行為。多項研究顯示，整合素α5、β5、β6在結直腸癌侵襲、轉移過程中發揮著重要作用[6-10]。本研究檢測不同分期結直腸癌患者及健康人血清外泌體整合素α5、β5、β6的表達情況，分析其與生存期的關系，探討整合素α5、β5、β6在結直腸癌診斷、治療及預后預測中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月-2020年10月就診于湖南省中醫藥研究院附屬醫院和湖南省腫瘤醫院的50例結直腸癌患者的血清標本。納入標準：年齡＞18歲，性別不限；符合結直腸癌診斷標準；未經放化療和手術的初診患者。排除標準：因其他疾病或事故死亡；依從性差不能隨訪。結直腸癌按照中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)結直腸癌診療指南[11]標準，經手術或病理活檢確診。按照國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control，UICC)及美國腫瘤聯合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期系統(第8版)[12]，將50例結直腸癌患者分為結直腸癌Ⅰ期組(n=5)、Ⅱ期組(n=19)、Ⅲ期組(n=14)與Ⅳ期組(僅肝轉移，n=12)。

收集2018年8月-2020年5月于湖南省中醫藥研究院附屬醫院健康管理中心體檢的10名健康者的血清標本作為健康對照組。經過詢問病史、體格檢查以及完善胃腸鏡、腫瘤標志物、影像學等檢查認定為無惡性腫瘤，且無腸道癌前病變如腺瘤、黑病變等，排除合并糖尿病、心腦血管疾病、肝腎疾病等慢性疾病及腫瘤家族史者。本研究通過湖南省中醫藥研究院倫理委員會[HZL(K)20180614-001-01C號]和湖南省腫瘤醫院醫學倫理委員會(SBQLL-2020-110)審核，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 外泌體提取試劑盒(EIQ3-01001 kit，171018，上海華盈生物醫藥科技有限公司)；四甲基乙二胺(TEMED；T105497，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；RIPA裂解液(P0013B，上海碧云天生物技術有限公司)；三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris；V900483，美國Sigma公司)；兔抗人HSP70抗體(ab181606)、兔抗人ALIX抗體(ab186249)、兔抗人整合素α5抗體(ab150361)、兔抗人整合素β6抗體(ab187155)、兔抗人整合素β5抗體(ab184312) (英國Abcam公司)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(GAPDH，10494-1-AP)、羊抗兔抗IgG HRP(SA00001-2) (美國Proteintech公司)。納米檢測儀(NanoFCM，廈門福流生物科技有限公司)；臺式冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；電泳儀、轉膜儀(北京六一生物科技有限公司)；搖床、旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；磁力攪拌器(上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 外泌體分離 按照外泌體提取試劑盒(EIQ3-01001 kit)說明書步驟操作，取血清標本于4 ℃下3000g離心10 min；取200 μl，加入50 μl提取試劑A，混勻后4 ℃靜置孵育30 min；室溫下3000g離心10 min，棄上清；用200 μl PBS重懸，向重懸液中加入50 μl試劑B，混勻后4 ℃靜置孵育30 min；室溫下3000g離心10 min，棄上清；用50～120 μl PBS重懸，分裝后于-80 ℃凍存待測。

1.3.2 納米微粒追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)外泌體[13-14]取凍存的外泌體樣品，25 ℃水浴解凍后，于冰上放置；取20 μl置于離心管中，加入980 μl已過濾的PBS溶液(樣本50倍稀釋)，反復吹打混勻，0.22 μm濾膜過濾，采用納米檢測儀進行分析，具體由上海逍鵬生物公司測定。

1.3.3 Western blotting鑒定外泌體及測定整合素α5、β5、β6表達水平 取外泌體樣品，根據BCA定量結果加入6×蛋白上樣緩沖液，金屬浴中煮沸變性，取20 μg上樣，行凝膠電泳，轉至PVDF膜上，5%封閉液封閉60 min，加入HSP70(1∶3000)、ALIX(1∶3000)、整合素α5(1∶3000)、整合素β6(1∶3000)、整合素β5(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜；次日用TBST及TBS洗滌，加入山羊抗兔二抗(1∶6000)室溫孵育90 min；用TBST洗滌3次，加入ECL化學發光液顯影，用Quantity One灰度分析軟件進行分析。

1.3.4 直腸癌患者生存期的影響因素分析 所有患者每1～2個月接受1次電話隨訪，隨訪日期從入組開始至患者出現本病相關死亡，隨訪截至2021年2月。生存期為從隨機化開始至死亡或末次隨訪時間。采用Kaplan-Meier法和Cox比例風險回歸模型分析預后影響因素。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，若符合正態分布和方差齊，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗或非參數檢驗。采用GraphPad Prism 8.0軟件制作粒徑圖，Quantity One灰度分析軟件進行Western blotting分析，實驗均重復3次。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 50例中，男26例(52.0%)，女24例(48.0%)，以中老年群體為主，平均58歲；年齡≤60歲者24例(48.0%)，＞60歲者26例(52.0%)；TNM分期Ⅰ期5例(10.0%)，Ⅱ期19例(38.0%)，Ⅲ期14例(28.0%)，Ⅳ期(僅肝轉移)12例(24.0%)；黏液性腺癌2例(4.0%)，低分化腺癌15例(30.0%)，中分化腺癌25例(50.0%)，高分化腺癌8例(16.0%)。隨訪截至2021年2月，隨訪時間5～60個月，中位隨訪時間44個月，無病例脫落或失訪。

2.2 外泌體鑒定結果 NTA分析結果顯示，各組血清外泌體的粒徑分布集中在50～150 nm(圖1)。Western blotting檢測結果顯示，各組血清外泌體中ALIX、HSP70等標志性蛋白均有表達(圖2)，證實提取物為外泌體，可進行后續實驗。

圖1 各組血清外泌體納米微粒追蹤分析(NTA)結果Fig.1 Nanoparticle tracking analysis (NTA) of serum exosomes in each group

圖2 各組血清外泌體標志蛋白ALIX、HSP70的表達情況(Western blotting)Fig.2 Expression of serum exosomes marker proteins ALIX and HSP70 in each group (Western blotting)

2.3 各組血清外泌體中整合素α5、β5、β6的表達情況 Western blotting檢測結果顯示，各組血清外泌體中整合素α5、β5表達水平較高，其水平隨著結直腸癌TNM分期增加而增高；結直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期組整合素α5、β5表達水平差異有統計學意義(P＜0.05)，整合素β6僅少量表達，其水平并不隨著TNM分期而呈一致性改變(P＞0.05)(圖3)。結直腸癌Ⅳ期組整合素α5、β5表達水平明顯高于結直腸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期組(P＜0.01)，結直腸癌Ⅲ期組明顯高于結直腸癌Ⅰ、Ⅱ期組(P＜0.01)，結直腸癌Ⅱ期組高于結直腸癌Ⅰ期組(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組血清外泌體中整合素α5、β5、β6的表達情況(Western blotting)Fig.3 Expression of integrin α5, β5 and β6 in serum exosomes of each group (Western blotting)

2.4 結直腸癌患者生存期的影響因素分析Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，整合素α5、整合素β5、TNM分期與結直腸癌患者生存期有關(P＜0.01)，病理分化程度、性別、年齡與結直腸癌患者生存期無明顯相關性(P＞0.05，圖4)。

圖4 結直腸癌患者生存期影響因素的Kaplan-Meier曲線分析Fig.4 Kaplan-Meier curve analysis of the influencing factors of survival of patients with colorectal cancer

Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，整合素α5及病理分化程度是結直腸癌患者生存期的獨立影響因素(P＜0.01，圖5、表1)。

圖5 基于整合素α5、病理分化程度的Cox比例風險回歸模型Fig.5 Multivariate Cox proportional hazards model of integrin α5 and the degree of pathological differentiation

表1 結直腸癌患者生存期影響因素的Cox比例風險回歸模型分析Tab.1 Multivariate Cox proportional hazards model analysis of the influencing factors of survival of patients with colorectal cancer

3 討 論

結直腸癌是2020年中國癌癥發病率第二、死亡率第五的惡性腫瘤[15]。肝轉移是結直腸癌患者死亡的主要原因之一。因此，深入探討結直腸癌肝轉移的機制具有重要意義。目前研究認為，惡性腫瘤的侵襲、轉移是一個動態連續的過程[16]。腫瘤細胞首先從原發部位脫落，侵入到ECM中，與基底膜細胞間質中的一些分子黏附，并激活細胞合成、分泌各種降解酶類，協助腫瘤細胞穿過ECM進入血管，然后在某些因子的作用下運行并穿過血管壁外滲到繼發部位，繼續增殖形成轉移灶[17]。

整合素作為細胞表面黏附分子家族的一員，是由α(120～185 kD)和β(90～110 kD)兩個亞單位經非共價鍵連接組成的異源二聚體，包括一段C端細胞質內區域和一段N端細胞外區域(β4除外)?，F已發現18種α亞單位和8種β亞單位。α、β鏈共同構成識別配體的結合點，構成20多種整合素。整合素在與ECM連接后，通過聚集(包括支架分子，如p130-CRK相關底物)、招募并激活激酶[如局部黏附激酶(FAKs)和src家族激酶(sFKs)]將ECM與肌動蛋白細胞骨架耦合[9]，直接或間接地影響腫瘤細胞的分化、增殖、遷移、凋亡及腫瘤血管的形成等[18-19]。有研究發現，整合素α5β1(ITGA5)可通過α5β1-纖連蛋白途徑促進原位腫瘤向遠處器官轉移[20]。Shao等[21]采用Western blotting檢測發現，與原始細胞相比，轉移性HT29細胞中整合素α5β1表達增加。Lu等[22]利用生物信息學方法分析了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)，結果顯示，ITGA5表達越高，結直腸癌患者的總生存率越低。Pelillo等[23]發現，肝臟微環境通過調節整合素α5β1及其信號通路(FAK)的活性來驅動大腸癌細胞沉降到肝臟中，而整合素α5β1與α2β1協同發揮作用，共同促進癌細胞在肝臟中的侵襲和擴散。整合素β5(ITGβ5/ITGαvβ5)是一種玻連蛋白受體[24]，可與αv亞基組成異二聚體，影響腫瘤的黏附、生長、遷移及侵襲等[25-30]。Hoshino等[31]通過定量質譜分析和Western blotting檢測發現，ITGβ5主要在肝嗜性細胞的外泌體中檢測到。同樣，有研究在黑色素瘤肝轉移、結直腸癌肝轉移、胰腺癌肝轉移及胃癌肝轉移的外泌體中均檢測到整合素β5[32]，提示整合素β5可調節肝轉移的傾向性。整合素αvβ6是僅存在于上皮源性惡性腫瘤的一類特殊亞型，與多種上皮性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關。Bates等[33]發現，啟動子轉錄調節因子-1(Ets-1)與整合素β6的轉錄激活及結腸癌患者的生存獲益存在相關性。Wang等[34]發現，整合素αvβ6通過內吞、胞吐循環直接參與細胞的遷移運動，為結腸癌細胞的肝轉移提供動力。本研究發現，各組血清外泌體中整合素α5、β5、β6均有不同程度表達，其中整合素α5、β5表達水平隨著TNM分期增加逐漸增高，且肝轉移Ⅳ期患者α5、β5表達水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者(P＜0.05)，提示整合素α5、β5與肝轉移、TNM分期有關。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，整合素α5、β5與結直腸癌患者生存期有關；Cox比例風險回歸模型分析顯示，結直腸癌患者整合素α5水平越高、病理分化程度越低，則預后越差，提示整合素α5、β5、病理分化程度與結直腸癌的預后有關。

值得注意的是，本研究發現，整合素β6在結直腸癌Ⅰ-Ⅳ期患者中均有表達，但各分期表達水平差異無統計學意義，這與既往Peng等[35]和Ahn等[36]的研究結果一致，提示整合素αvβ6表達水平與結直腸癌良惡性無明顯關聯，總體生存率或臨床病理特征與整合素αvβ6表達無明顯相關性。但Peng等[35]和Ahn等[36]的研究僅對整合素αvβ6進行單因素分析，未對其相互作用因子如Ets-1、磷酸化細胞外信號調節激酶2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 2，p-ERK2)或尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)以及真核細胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E)等進行分析，因為結直腸癌患者在同時表達上述因子和整合素αvβ6時更容易出現復發轉移[35]，或者這些因子可增強整合素αvβ6的效力[8]，或者整合素β6同時受Ets-1和eIF4E的調節才能發揮作用[7]，且β6的表達可能提示化療耐藥，導致患者生存率明顯降低[37]，但并不意味著整合素β6的表達與分期呈一致性[36]。

本研究存在一定的局限性：未對整合素β6的相互作用因子進行研究；未對其他Ⅳ期如肺部、遠處淋巴結轉移等患者進行同期研究，以明確整合素α5、β5是否引導結腸癌細胞定向轉移至肝臟組織；未進行深入的細胞、動物實驗加以驗證。

綜上所述，本研究結果表明，整合素α5、β5參與了結直腸癌的侵襲、遷移過程，是導致結直腸癌肝轉移的原因之一，可能成為潛在的血清標志物。該結果為深入挖掘整合素α5、β5作為結直腸癌浸潤轉移的預測分子以及結直腸癌肝轉移的作用機制提供了理論依據，但仍需進行多中心、大樣本的臨床與基礎研究，以確定整合素α5、β5對結直腸癌的診斷、治療及預后價值。