imFISH循環腫瘤細胞檢測結果與惡性腫瘤患者臨床特征及預后的關系*

李 敏，豆小文，劉 丹，熊 丹，張秀明△

1.安徽理工大學醫學院，安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖醫院集團羅湖區人民醫院/深圳大學第三附屬醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001；3.深圳市羅湖醫院集團羅湖區人民醫院/深圳大學第三附屬醫院甲乳外科，廣東深圳 518001

2020年，全球新發惡性腫瘤病例約1 930萬例，死亡病例達1 000萬例，呈逐年增長趨勢，全球女性乳腺癌新發病率已超過肺癌成為排名第一的惡性腫瘤；我國乳腺癌發病例數高居全球第一位，死亡率位居前列的惡性腫瘤依次為肺癌、結直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[1]。病理活檢雖為診斷惡性腫瘤的金標準，但對患者有侵入性損傷，取材位置有限，無法動態監測術后腫瘤復發轉移；影像學可動態監測患者病情，但對微小病變無法準確識別(可檢出病變的最小直徑為2～3 mm)，對患者有放射性損傷，且檢查結果會受判斷者的主觀因素影響。因此，尋找靈敏、便捷的診斷靶標以實現對惡性腫瘤的早期診斷、復發轉移動態監測、預后評估等是當前的研究熱點。循環腫瘤細胞(CTCs)雖不是血液循環中唯一的腫瘤衍生物，但它們包含一群轉移性前體[2-3]，對疾病進展至關重要，可提供癌癥生物學的信息，用于監測疾病進展，并有可能用于指導個性化的癌癥治療。目前，CTCs的研究主要集中在方法學開發階段，如膜過濾法[4]、免疫磁珠法[5]、基于物理或生物特性和免疫細胞化學法的微流控芯片技術[6-7]和流式細胞術等，尚未進行廣泛的臨床應用，其應用價值仍在探索中。有研究報道，可將免疫磁珠陰性富集聯合免疫熒光原位雜交術(imFISH)在臨床上應用于各種惡性腫瘤CTCs的檢測，但以往的研究大多僅聚焦于其在單一惡性腫瘤中的應用價值[8-9]。本研究采用imFISH CTCs檢測技術，考察了多種常見惡性腫瘤患者的外周血CTCs陽性率，分析了CTCs陽性率與臨床分期、病灶最大徑、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移以及與常見腫瘤標志物之間的關系，旨在探討CTCs檢測在多種惡性腫瘤診斷及預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年6月至2020年11月于深圳市羅湖醫院集團羅湖區人民醫院就診的惡性腫瘤患者的臨床資料，包括CTCs檢測結果、臨床病理資料及實驗室檢查結果等。納入經病理活檢證實且有明確病史資料的惡性腫瘤患者共235例，其中乳腺癌80例、肺癌53例、結直腸癌31例、心臟肉瘤14例、胃癌12例、子宮內膜癌12例、肝癌7例、食管癌7例、輸尿管惡性腫瘤6例、宮頸癌5例、胰腺癌5例、前列腺癌2例、腎細胞癌1例。患者中位年齡56歲，年齡范圍28～85歲；男107例、女128例。外周血標本采集時間點包括未接受治療(外科手術、放化療、新輔助治療等)、術后化療及復發轉移期。

1.2儀器與試劑 包括ACD保養管(美國BD公司)、低速離心機(上海安亭科學儀器廠)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、雜交儀(Dako公司)、Cyttel?染色體擴增型CTCs檢測系統(江蘇萊爾生物醫藥科技有限公司，采用免疫磁珠陰性富集聯合imFISH檢測技術)。

1.3方法

1.3.1CTCs陰性富集 足量采集外周血至ACD保養管(5 mL)2管(其中1支用于復查)。采血完畢后立即輕輕顛倒混勻8次，24 h內于室溫(15～30 ℃)進行CTCs陰性富集。嚴格參考說明書進行操作，主要步驟：(1)以600×g離心5 min，分離并去除血漿；(2)將紅細胞裂解液加至標本中，混勻，裂解紅細胞8 min后以600×g離心5 min，收集沉淀的細胞團；(3)在收集的細胞團中加入100 μL免疫磁微粒，室溫振蕩孵育20 min，去除白細胞；(4)磁吸附，收集細胞懸液，涂于玻片固定并干燥。

1.3.2imFISH檢測 在制備好的玻片標本上滴加CEP8探針10 μL，于雜交儀中變性(75 ℃，5 min)、雜交(37 ℃，1.5 h)。滴加抗CD45抗體孵育1 h后，加DAPI染核，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3鑒定與判讀 將CEP8+CD45-DAPI+的細胞計為CTCs(CEP8熒光探針信號點≥3個)，健康人CTCs計數的參考范圍為0～1個/3.2 mL，CTCs≥2個/3.2 mL的患者為CTCs陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS24.0軟件進行統計學處理。計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism軟件繪制數據統計圖。

2 結 果

2.1惡性腫瘤患者CTCs陽性率 惡性腫瘤患者CTCs總陽性率為65.53%(154/235)。在235例惡性腫瘤患者中，未接受相關治療患者48例，其CTCs陽性率為54.17%(26/48)，與術后化療患者CTCs陽性率[61.79%(76/123)]比較，差異無統計學意義(χ2=0.833，P=0.361)。經CT檢查確診為復發轉移的患者有64例，CTCs陽性率為81.25%(52/64)。不同類型惡性腫瘤患者CTCs檢測結果：乳腺癌患者CTCs陽性率為41.25%(33/80)，肺癌患者CTCs陽性率為73.58%(39/53)，兩者CTCs陽性率比較差異有統計學意義(χ2=13.425，P<0.05)。由于其他癌種的病例數較少，故未納入統計。乳腺癌與肺癌患者中未接受相關治療、術后化療和復發轉移的3類患者CTCs陽性率見圖1。

圖1 乳腺癌和肺癌CTCs陽性率變化

2.2CTCs與腫瘤臨床特征的關系 不同臨床分期患者CTCs陽性率：Ⅰ～Ⅱ期患者陽性率最低，為38.37%；Ⅲ期患者CTCs陽性率為69.49%；Ⅳ期患者CTCs陽性率最高，為88.89%；Ⅰ～Ⅱ期與Ⅳ期患者CTCs陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=50.232，P<0.05)。CTCs計數最多(12個/3.2 mL)的患者病灶最大徑>5 cm，有淋巴結和遠處轉移，臨床分期為Ⅳ期。CTCs陽性率與臨床分期、病灶最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移有關(P<0.05)。見表1。

表1 CTCs與235例惡性腫瘤患者的臨床分期、80例乳腺癌分子分型的關系

2.3血清腫瘤標志物水平與CTCs陽性率的關系 不同癌胚抗原(CEA)和糖類抗原(CA)153水平的乳腺癌患者CTCs陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。不同CEA、CA125、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)和鐵蛋白水平的肺癌患者CTCs陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CTCs陽性與乳腺癌和肺癌常見腫瘤標志物之間的關系

2.4動態監測6例惡性腫瘤患者的CTCs計數 選取CTCs連續監測4次以上且臨床分期處于Ⅱ期以上的6例常見惡性腫瘤患者，以CTCs核形變化情況將其分為核體積變化穩定組和核體積變化波動組進行觀察，觀察患者CTCs計數、核形態變化情況、疾病進展情況、治療反應。(1)CTCs核體積變化穩定組。患者2為肺腺癌患者，監測過程中，共檢出CTCs 3次；第1次CTCs核體積大，后兩次核體積較小；該患者行左肺腺癌術后化療，CTCs從6個/3.2 mL降至3個/3.2 mL，2個月后降為1個/3.2 mL，；疾病緩解，接受靶向治療，預后良好。患者4為子宮內膜癌患者，在監測過程中，共檢出CTCs 8次；該患者子宮內膜癌術后接受放療并行輔助化療，CTCs檢測顯示核體積較小，數量增加，1年后復發轉移，CTCs增加至7個/3.2 mL；行腫瘤免疫治療后CTCs降至1個/3.2 mL，提示預后良好，免疫治療效果有效。患者5為乳腺癌患者，監測過程中，共檢出CTCs 2次，核體積基本無變化；該患者左乳癌術后行內分泌治療，CTCs為2個/3.2 mL；隨著治療的進行，CTCs降至0，患者預后良好。見圖3。(2)CTCs核體積變化波動組。患者1為升結腸中分化腺癌患者，連續9次監測均檢出CTCs；該患者術后復發轉移，CTCs核體積大，連續6次CTCs監測，核體積變化明顯，行姑息性化療后CTCs核體積先減小后增大，最后患者死亡。患者3為右肺上葉中低分化鱗狀細胞癌患者，連續13次監測，均檢出CTCs；該患者確診后，未行手術切除，CTCs核體積較大；3個月后體積減小，CTCs計數降低至2個/3.2 mL，但2個月后CTCs計數增加至4個/3.2 mL，該患者疾病進展，接受腫瘤免疫治療。患者6為胃癌術后多發肝轉移，連續8次監測，均檢出CTCs，核體積隨疾病進展變化頻率增大；該患者行化療后，CTCs計數均≥4個/3.2 mL，3個月后CTCs達到12個/3.2 mL，最后患者死亡。

注：患者1為結腸癌患者；患者2、3為肺癌患者；患者4為子宮內膜癌患者；患者5為乳腺癌患者；患者6為胃癌患者。

3 討 論

惡性腫瘤的早期、伴隨診斷及預后監測一直是臨床關注焦點，隨著CTCs檢測技術從科研走向臨床，CTCs檢測取材便捷、易于動態監測和有助于預后評估的特點使其在臨床中的應用受到關注。本研究中，imFISH CTCs檢測多類惡性腫瘤的總陽性率為65.53%，與趙振坤等[10]報道相近(CTCs陽性率為76.6%)。CTCs檢測技術最早應用于乳腺癌的檢測，因此相關文獻報道較多，然而王瑞娟等[11]報道乳腺癌CTCs陽性率不高(陽性率為55.56%)，與本研究結果相似(陽性率僅為41.25%)，而與LOEIAN等[12]運用納米管-CTCs芯片檢測Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌CTCs陽性率為100.0%的結果有明顯差異。上述結果提示，CTCs陽性率與檢測方法密切相關，本研究采用的CTCs陰性富集法聯合8號染色體拷貝數變異的imFISH方法在乳腺癌中的診斷靈敏度可能還有待提高。本研究中，復發轉移患者CTCs陽性率為81.25%，與未接受相關治療和術后化療患者有明顯差異，這表明CTCs檢測有助于監測癌癥患者的復發轉移，這可能與CTCs在轉移過程中發生上皮間質轉化(EMT)和CTCs具備腫瘤干細胞的特性有關[13]。

本研究中，CTCs與病灶最大徑、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移、臨床分期等有關，與以往研究結果一致[14-15]。雖然臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者CTCs陽性率(38.37%)低于Ⅳ期(88.89%)，但這也表明早期惡性腫瘤患者外周血即已存在CTCs，隨著疾病的惡化，CTCs陽性率升高。有淋巴結轉移者和有遠處轉移者其CTCs陽性率高于未發生轉移患者，這表明若CTCs數量增多則提示腫瘤存在轉移的可能性。此外，本研究分析了80例乳腺癌患者CTCs的存在與乳腺癌Her-2分型及三陰性乳腺癌的關系，結果顯示CTCs的陽性率在Her-2陰性與Her-2陽性乳腺癌之間無明顯差異，在三陰型與非三陰型乳腺癌間也無明顯差異，與張娜賢等[16]等運用imFISH檢測CTCs所得到的結果相同，提示imFISH CTCs檢測尚不能區分不同乳腺癌分型。

血清學腫瘤標志物的檢測雖在特異度和敏感度方面欠佳，但因其檢測簡便，已作為常規檢測項目用于惡性腫瘤的早期診斷、治療監測和復發轉移等。本研究分析了乳腺癌和肺癌的CTCs陽性率與常見腫瘤標志物(CEA、CA125、CA153、NSE、CYFRA21-1和鐵蛋白)檢測結果的關系，結果表明CTCs與上述腫瘤標志物的檢測結果均無相關性。乳腺癌中的結果與趙振坤等[10]的報道相同，而肺癌中的結果與TAN等[17]的報道不相同(該研究認為肺癌患者CTCs與CEA、CA125、CA153檢測結果存在一定相關性)，與ZHENG等[18]的報道也不相同(該研究認為CTCs與CEA的檢測結果有相關性，并將兩者的檢測聯合應用于指導肺癌患者治療)。本研究表明，CTCs作為惡性腫瘤患者綜合監測的指標可能優于現有的常見血清腫瘤標志物，但要還需進一步進行大樣本量的統計分析。

本研究使用的CTCs檢測方法對細胞的大小、形態無影響，因此分析了6例連續檢測CTCs的惡性腫瘤患者。結果顯示，終點事件為預后不良或死亡的患者，即使在治療期間其CTCs細胞核體積變化也無規律，大小變化頻繁，且CTCs計數也變化不定；而預后良好者，在治療期間CTCs細胞核體積變化大多為減小(患者5雖然2次檢出CTCs細胞核體積無明顯改變，但這可能與兩次檢測間期短且檢測次數少有關；患者4發生復發轉移時，CTCs細胞核體積稍有增大且CTCs計數增加，但隨治療的繼續進行，CTCs數量降為2個/3.2 mL以下)。本研究表明，CTCs細胞核體積變化規律及檢出數量可以預測腫瘤患者復發轉移，尤其可作為預后判斷的重要指標之一。

本研究不足之處在于納入研究的各類惡性腫瘤臨床病例樣本量不夠大。本研究表明，CTCs的陽性率可能為惡性腫瘤患者的臨床分期、復發轉移的預測提供參考，CTCs的數量和細胞核體積可能成為評估復發轉移、治療效果及預后判斷的指標。