miR-637在橋本甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌患者組織穿刺標本中的水平變化及對甲狀腺癌細胞增殖、侵襲的影響

車勇軍，連 蕾，侯 鈺，曹海波

邯鄲市中心醫院：1.普通外科；2.耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲 056001

橋本甲狀腺炎(HT)是一種自身免疫性甲狀腺炎，又稱慢性淋巴細胞性甲狀腺炎；甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種惡性程度較低的甲狀腺腫瘤，約占甲狀腺癌的85%，其發生會受到激素、遺傳、環境等因素的影響[1]。HT和PTC之間的關系是一個有爭議的問題，HT也可能導致PTC的出現，但目前尚無定論，其病理過程和機制尚不清楚，因此探討其分子機制尤為重要[2]。微小RNA(miRNA)是重要的表觀遺傳學調控分子，長度為20～24個核苷酸，其在細胞內具有多種重要的調節作用[3]。臨床上miRNA可以作為區分單純HT與HT合并PTC的獨立分子標志物[4]。有研究表明miR-637可能受到LncRNA HOTTIP調控，在PTC細胞增殖、侵襲和遷移過程中發揮重要作用[5]，也有研究表明miR-637/HEMGN軸可以受到Circ PSD3調控促進PTC的進展[6]。一項對107例PTC患者的研究表明，MMP家族關鍵蛋白基質金屬蛋白酶2(MMP2)和Caspase家族關鍵蛋白Caspase-3表達與預后具有顯著的相關性[7]，細胞學研究表明甲狀腺癌細胞中PLGF的過表達增加了基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達，而抑制PLGF的表達降低了MMP9的表達，以上均提示出MMP家族蛋白是甲狀腺癌重要的調控因子，探討MMP家族與miRNA的調控關系有助于臨床對HT和PTC機制的認識[8]。因此，本研究將探討HT合并PTC患者穿刺組織標本中miR-637的水平相較于單純HT患者是否有差異，通過細胞學實驗探討miR-637對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，并通過MMP家族蛋白檢測分析其機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2019年6月至2021年6月于本院治療的92例HT患者的甲狀腺組織穿刺標本，其中單純HT患者46例(單純HT組)，HT合并PTC患者46例(HT合并PTC組)。兩組患者年齡、性別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)患者經病理組織學檢查確診為HT或HT合并PTC；(2)無頭頸部放射治療史；(3)癌癥無遠處轉移；(4)臨床資料詳細完整。排除標準：伴有其他全身性疾病。本研究中所有患者均簽署知情同意書并通過本院倫理委員會審核。收集上述患者的甲狀腺/甲狀腺癌組織穿刺標本用于后續實驗。人甲狀腺癌細胞株TPC-1購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2儀器與試劑 高糖培養基DMEM購于美國corning公司，胎牛血清和青鏈霉素購于澳大利亞Ausbian公司；10 cm細胞培養皿、50 mL離心管、15 mL離心管購于美國Corning公司；miR-637質粒及陰性對照(NC)質粒等購于廣州Ribobio公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CCK8細胞增殖及毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；實時熒光定量PCR(qPCR)儀購于瑞士羅氏公司，Western blot電泳儀購于美國Bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1qPCR檢測組織穿刺標本中的miR-637水平 將組織穿刺標本在液氮中進行研磨，采用miRNA cDNA Synthesis Kit進行反轉錄,合成cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix Kit進行miR-637的qPCR檢測，所有操作在冰上進行并避免RNA酶污染。使用7500 Fast系統進行實時熒光定量PCR，檢測條件設置：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃20 s，40個循環。miR-637正向引物為5′-ACTGGGGGCTTTCGGGCTCTGCGT-3′，U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATA-3′，反向引物均為通用引物，使用U6作為內參，以2-ΔΔCt計算miR-637相對表達水平。

1.3.2細胞培養及轉染 TPC-1培養：DMEM培養液(內含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL)，置CO2培養箱內，5%CO2，37 ℃靜置培養。細胞轉染：用胰酶消化細胞后重選，嚴格按照轉染試劑盒Lipo3000(Invitrogen公司)說明將NC質粒和miR-637質粒進行轉染，8 h后，更換為完全培養基，置于5%CO2培養箱中37 ℃培養，48 h后分別作為NC組和miR-637組用于后續實驗[8]。未進行轉染的細胞作為對照組。

1.3.3CCK8法檢測細胞株TPC-1的細胞活力 嚴格按照CCK8檢測試劑盒(北京索萊寶公司)說明書進行操作：對照組細胞轉染24 h后，細胞以2×103的密度接種到96孔板中，在37 ℃下培養24 h，向每孔加入10 μL CCK8溶液，此過程避免孔中生成氣泡[氣泡會影響吸光度(A)的讀數]，將培養板在培養箱內孵育1.5 h，用酶標儀測定在450 nm 處的A值。

1.3.4細胞劃痕實驗 將各組狀態良好的TPC-1細胞進行消化，調整為1×106個/mL，接種到6孔板，24 h后用10 μmL槍頭垂直劃痕，劃痕后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕清洗細胞2～3次，去除劃痕后漂浮的細胞，加入無血清培養基。放入37 ℃ 5%CO2培養箱培養，24 h后拍照(放大倍數為200倍)。

1.3.5Transwell侵襲實驗 將各組狀態良好的TPC-1細胞進行消化，吹打均勻，調節密度104～105個/mL，吸取0.4 mL細胞懸液接種于Transwell小室，下室培養基300 μL含10%FBS，將24孔板置于培養箱中孵育24 h后，嚴格按照Transwell試劑盒說明(美國corning公司)染色后在顯微鏡下觀察拍照(放大倍數為200倍)，每組細胞小室中隨機選擇3個區域進行拍照并進行定量分析[11]。

1.3.6Western blot 檢測蛋白表達 將各組狀態良好的TPC-1細胞置于1 mL RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓120 V 1.5 h，后轉至PVDF膜，用5%BSA封閉。加入特異性一抗MMP2(1∶2 000，Abcam)，MMP9(1∶10 000，Abcam)和GAPDH(1∶10 000，Abcam)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學發光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統進行半定量分析。

2 結 果

2.1miR-637在單純HT組與HT合并PTC組患者甲狀腺/甲狀腺癌組織中的表達水平比較 與單純HT組相比，HT合并PTC組miR-637表達水平顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注:與單純HT組比較，**P<0.01。

2.2miR-637對人甲狀腺癌細胞TPC-1細胞活力的影響 與對照組相比，miR-637組細胞增殖能力出現下降，具體表現為24、48、72 h的A值均低于同一時間對照組的A值(P<0.05)，而NC組和對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-637對人甲狀腺癌細胞TPC-1細胞活力的影響值)

2.3miR-637對人甲狀腺癌細胞TPC-1遷移和侵襲的影響 通過劃痕實驗分析各組細胞遷移能力，見圖2。與對照組相比，miR-637組細胞遷移能力降低，具體表現為miR-637組細胞劃痕寬度寬于對照組(P<0.05)，而NC組和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。通過Transwell實驗分析細胞侵襲能力，結果表明與對照組相比，miR-637組細胞侵襲能力降低，具體表現為miR-637組細胞侵襲數少于對照組(P<0.05)，而NC組和對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：和對照組比較，*P<0.05；和NC組比較，#P<0.05。

2.4miR-637對人甲狀腺癌TPC-1細胞MMP2和MMP9蛋白表達的影響 與對照組相比，miR-637組MMP2和MMP9蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.01)；NC組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

HT以甲狀腺特異性自身抗體為特征，是最常見的自身免疫性疾病之一[9]。雖然確切的病因尚未完全闡明，但HT與遺傳因素、環境因素和表觀遺傳之間具有相關性[10]。HT與其他組織細胞惡性轉化之間的關系在既往研究中被提出，并涉及免疫系統和激素分泌水平的異常，其可能進一步引發PTC，但仍存在爭議，需要進一步深入研究[11]。PTC是上皮性惡性腫瘤，表現為濾泡細胞分化和一系列獨特的細胞核特征[12]，是最常見的甲狀腺腫瘤，總體預后較好，少數情況下它可能有囊性特征。大約10%的患者在最初表現時可能出現轉移性疾病，45歲以下的患者總體預后良好[13]。有研究發現右側氣管旁淋巴結轉移(RPTLNM)、甲狀腺外延伸、包膜侵犯和多灶性等因素均是HT合并PTC的風險因素[14]。本研究納入了92例HT患者，并以是否合并PTC為分組標準，確認了單純HT患者的組織穿刺標本中miR-637水平較高，而HT合并PTC患者中，miR-637水平較低，提示miR-637可能成為一種鑒別診斷單純HT與HT合并PTC的標志物。

miR-637是多種腫瘤、心血管等疾病的關鍵調控分子，研究表明miR-637通過靶向降解AKT1從而抑制肝癌細胞的增殖和侵襲,過表達miR-637會導致肝癌細胞增殖受到顯著抑制并減弱細胞侵襲，而抑制miR-637表達則顯示出相反的生物學效應[15]；也有研究指出miR-637可以抑制膽管癌細胞QBC939的增殖，其機制與干擾組織蛋白酶B(CTSB)表達有關[16];有臨床實驗通過對86例動脈粥樣硬化患者和75例健康對照者的分析，發現miR-637可以作為動脈粥樣硬化患者診斷的獨立判斷指標，在臨床診斷及對未來心血管事件的預測中具有重要意義[17]?；趍iR-637的重要功能及以上重要研究結果，本研究對臨床標本中miR-637的表達差異進行了機制研究，通過CCK8、侵襲等細胞學實驗探討了miR-637對甲狀腺癌細胞腫瘤生物學功能的影響，結果發現miR-637可以顯著地抑制甲狀腺癌細胞的活性，并且降低了其遷移能力和侵襲能力。腫瘤轉移的方式有直接蔓延和種植性轉移等方式，其過程都需要破壞腫瘤周圍的細胞組織，此過程伴隨著基質金屬蛋白酶家族成員的作用[18]。研究表明MMP2 1306 C/T基因多態性可能增加前列腺癌的風險，尤其是在亞洲人群中更加顯著[19]；而MMP9可以切割許多細胞外基質蛋白來調節細胞外基質重塑，可以切割許多血漿表面蛋白質，不僅與腫瘤的侵襲、轉移和血管生成相關，還可以作為腫瘤診斷的獨立生物標志物[20]。本研究表明miR-637轉染后可以顯著抑制MMP2和MMP9的表達，從而降低細胞降解胞外基質的能力，抑制細胞的遷移和侵襲，由此推測miR-637在單純HT患者穿刺組織標本中的水平高于HT合并PTC的患者可能與臨床表征有一定的相關性，即miR-637低表達后，促進了正常的甲狀腺細胞的異常增殖、異常遷移與侵襲，甚至導致其具有了癌細胞的典型特征，但這是否為HT患者合并PTC的原因還有待進一步探討。

綜上所述，本研究證實miR-637在HT合并PTC患者穿刺組織標本中低表達，可能成為臨床診斷的生物標志物，并且miR-637可以抑制人甲狀腺癌細胞活性，降低細胞遷移能力和侵襲能力，其機制與基質金屬蛋白酶表達抑制相關。未來的研究可以進一步擴大臨床樣本量，通過主成分分析和受試者工作特征(ROC)曲線等分析探討miR-637是否可以準確診斷或預測HT合并PTC，以及通過熒光報告實驗探討miR-637是否與基質金屬蛋白酶有靶向關系，為臨床診斷和治療提供新思路。