SLC2A9基因rs13137074位點雙熒光素酶報告系統的構建及其對基因活性的影響

陳鄔錦,瑪依娜·卡哈爾,田婷婷,李 瑞,梁美婷,4,賀 怡,4,崔月娜,劉業洲,白 冰,孫玉萍△

新疆醫科大學基礎醫學院：1.形態中心；2.微生物教研室；3.人體寄生蟲學教研室，新疆烏魯木齊 830011；4.新疆第二醫學院，新疆克拉瑪依 834000

高尿酸血癥(HUA)可導致痛風，與慢性炎癥及衰老的機制存在關聯[1]。人體每天約2/3的尿酸經腎臟排出，腎臟中參與尿酸排泄的轉運體可大致分為尿酸再吸收轉運體和排泄轉運體2類[2-3]。葡萄糖易化轉運蛋白-9(SLC2A9)屬于尿酸再吸收轉運體位于腎小管上皮細胞基側，參與尿酸鹽的體內轉運和排出[4]。對SLC2A9基因調控區域的功能研究可闡釋HUA的發病機制[5]。本課題組前期對SLC2A9基因單核苷酸多態性(SNP)的測序發現rs13137074位點的多態性與尿酸代謝存在關聯[6]。有研究指出該位點的基因多態性可能與機體尿酸代謝紊亂相關[7]，但并未具體闡明rs13137074位點突變是否與SLC2A9基因的轉錄存在關聯。因此，本研究通過定點突變技術聯合雙熒光素酶報告系統觀察rs13137074位點對SLC2A9基因轉錄的影響，為進一步了解HUA的發病機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料 人胚胎腎細胞293T細胞株購自青旗(上海)生物技術發展有限公司。質粒提取試劑盒DNA提取試劑盒購自Qiagen公司，pGL3-Basic質粒、pGL3-Control質粒、pGL3-rs13137074-A重組質粒、pRL-TK內參質粒及pAcGFP1-C1質粒均購自通用生物系統(安徽)有限公司，KpnⅠ、XhoⅠ限制性內切酶購自美國BioLabs公司，T4 DNA Ligase購自Takara(大連)生物技術有限公司，Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司，引物、DNA片段合成及膠回收試劑盒等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1雙熒光素酶報告基因質粒構建

1.2.2SLC2A9基因rs13137074位點野生型及突變質粒構建 (1)基因位點合成：將KpnⅠ及XhoⅠ酶切位點分別合成至rs13137074位點的野生型和突變型上、下游，備用。(2)質粒連接：將空載質粒pGL3-Basic 900 ng加入由CutSmart 5 μL、KpnⅠ及XhoⅠ酶各1 μL、ddH2O 42 μL共同組成的酶切體系中，37 ℃水浴15 min，再60 ℃水浴30 min，取出后4 ℃過夜保存。取上述合成片段3 μL、開鏈pGL3-Basic質粒1 μL加入由10×ligation 2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL及ddH2O 3 μL組成的連接體系中4 ℃連接過夜。(3)質粒轉導：取連接好的質粒2 μL與50 μL DH5α感受態細胞混懸液混合后冰上靜置15 min。將上述混合物全部加入電擊杯中，于25 μF、200 Ω、2 500 U、2 mm條件下電擊，取出后迅速加入500 μL LB培養液置搖床160 r/min 37 ℃孵育1 h。取出培養液將其涂布于含有氨芐西林(AMP)的平板中37 ℃過夜培養，挑取單個菌落液體擴增備用。(4)無內毒素質粒提取:取上述培養液5 mL，以3 000 r/min離心10 min棄上清液，加入1 mL Bacterial Endotoxin Erasol顛倒混勻4～6次12 000 r/min離心1 min棄上清液，重復清洗2次后用參照質粒抽提試劑盒進行質粒抽提。(5)質粒鑒定：將抽提質粒參照(2)酶切鑒定成功后送測序、并與參比序列比對完全一致后備用。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測轉錄活性檢測[8](1)細胞復蘇與傳代：將人胚胎腎細胞(293T)從液氮中取出后遵循“慢凍快融”原理進行復蘇和凍存，傳代標準為細胞貼壁融合達90%時。細胞培養液為DMEM完全培養基(含雙抗及10%胎牛血清)。培養特殊要求為飽和濕度。(2)質粒轉染條件摸索：將含有DMEM培養基50 μL，1 μL水平為1～5 μg/μL的哺乳動物表達載體(pAcGFP1-C1)質粒，2 μL P3000TM轉染體系中加入0.375、0.750 μL Lipofectamine 3000試劑并各自設立24 h組及48 h組，共4組每組3個平行樣品，混勻后室溫靜置15 min備用。將上述混合液全部轉移至貼壁生長好的293T細胞培養板中置細胞培養箱中分別按照24 h和48 h繼續培養。(3)實驗分組：共設陽性對照組(pGL3-Control質粒)、陰性對照組(空載pGL3-Basic質粒)、SLC2A9基因rs13137074位點野生型組(pGL3-SLC2A9-WT質粒)和SLC2A9基因rs13137074位點突變型組(pGL3-rs13137074-A質粒)4組，每組3個平行樣進行檢測。每組按照均20:1的比例加入目標質粒及pRL-TK內參質粒。(4)雙熒光素酶活性檢測：按照(2)所得最佳培養時間取出轉染細胞，平衡至室溫后取150 μL細胞加入裝有150 μL已制備的Dual-Glo Luciferase試劑的EP管中室溫靜置30 min。待細胞充分裂解后吹打混勻后避光條件下取75 μL加入黑色96孔板中，靜置30 min后檢測螢火蟲熒光素酶熒光值。隨后向每孔添加已制備的Dual-Glo Stop& Glo試劑75 μL靜置30 min后檢測海腎熒光素酶的熒光值。熒光素酶活性=海腎熒光素酶熒光值/螢火蟲熒光素酶的熒光值。

2 結 果

2.1雙酶切鑒定結果 將野生型質粒pGL3-SLC2A9-WT與突變型質粒pGL3-rs13137074-A經雙酶切后電泳顯示目標片段連接成功，均出現了2條明顯的條帶見圖1。

注：A為野生型質粒酶切電泳圖；B為突變型質粒酶切電泳圖；M為分子標準帶；1為雙酶切前野生型質粒；2為雙酶切后野生型質粒；3為雙酶切前突變型質粒；4為雙酶切后突變型質粒。

2.2質粒測序結果 野生型質粒pGL3-SLC2A9-WT測序結果經分析與參比序列完全一致，見圖2。

圖2 pGL3-SLC2A9-WT部分測序峰圖

2.3質粒轉染條件摸索 經檢測轉染試劑Lipofectamine 3000在0.75 μL/孔(24孔板)效果最好，即每1mL培養液中需加入1.5 μL Lipofectamine 3000試劑，最佳轉染時間為48 h。

2.4SLC2A9基因rs13137074位點對轉錄活性影響檢測結果 經雙熒光素檢測可得轉染rs13137074位點突變型報告載體，與野生型載體相比，其熒光素酶活性顯著下調了23.60%，見表1。

表1 雙熒光素酶檢測SLC2A9基因rs13137074位點對轉錄活性的影響

3 討 論

尿酸是嘌呤代謝的終產物，在體內主要以尿酸鹽的形成存在于血清中，作為一種氧自由基的清除劑，參與機體多種細胞的抗氧化、抗衰老及代謝過程[9]。體內過高濃度的尿酸會引起高尿酸血癥、慢性腎病及痛風等疾病；而過低濃度的尿酸則會引起人體出現多種炎癥及與誘發抗氧化能力下降相關疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森及多發性硬化癥等[10]。人體尿酸平衡的維持主要依賴于腎臟對尿酸鹽的重吸收和排泄，SLC2A9作為腎臟尿酸鹽排泄途徑中重要轉運體之一[11]，該基因的突變與腎臟引起的HUA存在顯著關聯[12]。SLC2A9基因除了在腎臟表達外還可表達于肝臟、胎盤和胰腺等多種細胞和器官中，同時也是癌癥抑制因子P53的直接靶基因，可有助于抗氧化防御作用[13]，目前報道的該基因的調控相關蛋白只有核受體家族成員(HNF)4α及PDZ結構域1(PDZK1)[14]。但其他與SLC2A9調控相關的基因尚未被深入研究，多項研究指出SLC2A9的多個位點SNP與血清尿酸水平存在關聯，但大多位于內含子非編碼區，且這些位點改變血尿酸水平的分子機制尚不清楚[15-16]。本課題前期在對本地區居民SLC2A9基因功能區突變與HUA的關聯研究中發現多個SNP與尿酸代謝異常存在關聯，但未涉及rs13137074位點SLC2A9基因轉錄活性的探索[6]。本研究定點突變rs13137074位點并通過雙熒光素酶檢測，發現該位點發生突變使得SLC2A9基因轉錄活性下調了23.60%。說明rs13137074位點位于SLC2A9基因轉錄的調控區，該基因的突變與SLC2A9基因轉錄存在明顯關聯。本研究的開展進一步證實了rs13137074位點SNP可影響SLC2A9基因的表達進而影響人群血尿酸水平。