Day 3非優質胚胎的新鮮周期不同時期單胚胎移植妊娠結局比較

潘璠，季悅，王沛青，徐何榮，王珊珊

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 生殖醫學和婦產醫學中心，南京 210008)

單胚胎移植(single embryo transfer，SET)在穩定妊娠率的同時可以降低多胎率，是輔助生殖技術(ART)未來的發展趨勢[1]。SET的重點在于對移植胚胎的評估與選擇，胚胎的種植潛能與其發育速度及其他形態學特征密切相關[2]。然而在臨床診療過程中，可能出現部分患者Day 3胚胎質量均為非優質、發育潛能欠佳的情況。如何有效利用這些非優質胚胎獲得較為理想的妊娠結局引起生殖科醫生的關注。

囊胚移植因其高種植率的優勢已受到廣泛關注。文獻報道，囊胚培養作為優選胚胎的方式之一，能在非優質胚胎中篩選出發育潛能稍好的胚胎，因此可以提高種植率[3-4]。而另有研究指出，囊胚培養并不能提高患者的累積臨床妊娠率和非優質胚胎的利用率，反而還可能降低卵子利用率[5-7]。因此結論不一致。

本研究旨在探討對于新鮮周期SET患者，當Day 3全部為非優質胚胎時，如何選擇合適的移植時期以獲得更好的妊娠結局，為胚胎移植策略提供新思路。

資料與方法

一、研究對象及分組

選擇2015年1月至2020年12月在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學科接受常規體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)的不孕癥患者527 例。

納入標準：(1)年齡<40 歲；(2)周期數≤2個；(3)患者Day 3胚胎均為非優質胚胎；(4)患者為自愿進行SET或身高<150 cm、體重<40 kg、有雙胎不良孕產史、疤痕子宮、宮頸機能不全等符合SET指征的人群；(5)移植前子宮內膜厚度>8 mm。

排除標準：(1)可能影響胚胎種植的因素，如子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等；(2)胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)周期/供卵周期。

根據患者意愿選擇移植時期，139例患者選擇 Day 3單卵裂期胚胎移植(single cleavage transfer，SCT)，納入SCT組；388例患者選擇Day 5單囊胚移植(single blastocyst transfer，SBT)，其中83例養成并移植囊胚，納入SBT組，305 例未養成囊胚而放棄移植。再按年齡將SCT組和SBT組分別分為兩個亞組，≤35歲SCT組(n=124)和36～39 歲SCT組(n=15)；≤35歲SBT組(n=75)和36～39 歲SBT組(n=8)。治療前，患者均簽署知情同意書。

本研究經南京大學醫學院附屬鼓樓醫院倫理委員會審批同意。

二、研究方法

1.控制性促排卵與取卵：促排卵過程按照本中心常規流程進行，根據患者自身情況采用常規促排卵方案，包括長方案、微刺激和拮抗劑方案、超長方案。B超下監測卵泡生長發育情況，待優勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG扳機，約36 h后經陰道B超引導下穿刺卵泡獲卵。將獲得的卵冠丘復合物(OCCC)經Gamete液(Vitrolife，瑞典)洗滌后放置于過夜預溫平衡后的IVF序貫培養液(Vitrolife，瑞典)培養皿中。

2.受精與胚胎培養：根據患者取卵當日精子情況，選用常規IVF或ICSI受精。IVF方案中，取卵3 h后，加入精子懸液，按照精：卵100 000∶1的比例共孵育5 h，采用機械法剝離顆粒細胞，將受精卵轉入G1序貫培養液(Vitrolife，瑞典)中在37 ℃、6% CO2、5% O2培養環境下進行胚胎體外培養。ICSI方案中，取卵3 h后，采用透明質酸酶剝脫顆粒細胞，培養1 h后行卵胞質內單精子注射，洗滌后同樣轉入G1序貫培養液(Vitrolife，瑞典)中培養。培養至Day 3進行卵裂胚評估，再將需繼續培養的胚胎轉移至G2序貫培養液(Vitrolife，瑞典)中，培養至Day 5進行囊胚評估。

3.胚胎評估：本研究根據伊斯坦布爾共識[8]進行胚胎評估，所有移植胚胎均為2PN來源。Day 3評估胚胎卵裂球數目、形態以及碎片比例，將其分為Ⅰ～Ⅳ級胚胎，其中7～12細胞的Ⅰ、Ⅱ級胚胎定義為優質胚胎，其余為形態學非優質胚胎。Day 3為2～3細胞及碎片≥50%的胚胎不在研究范圍內。囊胚評估依據Gardner囊胚評分系統[9]，對囊胚腔擴張程度、內細胞團以及滋養細胞層的質量進行評分，評分≥Ⅰ期視為可移植囊胚(不包含內細胞團及滋養細胞層評分均為C的囊胚)，評分≥3BB為優質囊胚。

4.移植與妊娠結局判斷標準：根據患者意愿及身體情況，行Day 3 SCT或Day 5 SBT。移植后常規進行黃體支持，14 d后檢測患者空腹外周血，血β-HCG>5 U/L為HCG陽性；移植4～6 周后行陰道B超檢查，若見孕囊和胎心則為臨床妊娠。

定期對患者身體情況和妊娠結局進行電話隨訪。記錄并計算臨床妊娠率、流產率、活產率、平均孕周、新生兒體重及出生缺陷發生率。

三、統計學方法

結 果

一、患者基本資料比較

本研究共納入單胚胎移植222個周期。其中Day 3單卵裂期胚胎移植(SCT組)139周期，Day 5單囊胚移植(SBT組)83周期。兩組患者間年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、基礎卵泡刺激素(bFSH)水平、促性腺激素(Gn)天數、Gn用量和移植前內膜厚度比較，均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

二、患者臨床妊娠結局比較

SCT組的臨床妊娠率和活產率與SBT組相比有增高的趨勢，流產率有降低的趨勢，但均無統計學差異(P>0.05)；兩組間平均孕周及新生兒出生體重均無統計學差異(P>0.05)；兩組均無新生兒出生缺陷(表2)。

在選擇SBT方案的388例患者中，養成囊胚83例，未養成囊胚而放棄移植305 例，周期取消率為78.61%(305/388)；共858枚胚胎培養囊胚，Day 5形成囊胚92枚，囊胚形成率10.72%(92/858)；Day 5形成優質囊胚7枚，優質囊胚形成率0.82%(7/858)。

三、不同年齡段患者妊娠結局比較

按年齡將SCT組和SBT組分別分為兩個亞組：≤35歲SCT組(n=124)和36～39歲SCT組(n=15)；≤35歲SBT組(n=75)和36～39 歲SBT組(n=8)。隨著年齡增加，SCT組與SBT組均呈現出臨床妊娠率及活產率降低、流產率增高的趨勢，但均無統計學差異(P>0.05)。同一年齡段中，SCT組與SBT組比較，臨床妊娠率及活產率有增高的趨勢、流產率有降低的趨勢，但均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

四、移植的囊胚質量對妊娠結局的影響

隨著移植Day 5囊胚質量的提高，患者臨床妊娠率和活產率隨之增高。相比于移植Ⅰ期囊胚，移植Ⅳ期囊胚患者的臨床妊娠率和活產率均顯著提高(P<0.05)(表4)。

討 論

囊胚培養可篩選出種植潛能較高的胚胎，使胚胎和子宮內膜的同步性更好[10]，所以近年來越來越多的生殖中心采取將Day 3胚胎繼續培養至Day 5囊胚移植的策略。但是囊胚移植也有不可忽視的隱患，如周期取消率顯著增高、早產的風險增加、單卵雙胎比例提高、性別比失衡等[11]。因此，對于單胚胎移植(SET)周期中Day 3胚胎均為非優質胚胎的患者，選擇合適的移植時期尤為關鍵。本研究結果顯示，此類患者新鮮周期單囊胚移植(SBT)的妊娠結局與單卵裂胚移植(SCT)相比沒有顯著差異，且囊胚培養導致周期取消率增加。因此，對于這類患者較早移植可能是更為可靠的移植策略。

囊胚培養的首要風險在于患者可能由于無囊胚形成而取消周期，對于Day 3均為非優質胚胎的患者而言更為顯著。有Meta分析指出，囊胚移植的周期取消率顯著高于卵裂裂胚移植，而累積活產率無顯著差異[12-13]。本研究結果顯示，SBT組的活產率與SCT組相比無顯著差異(26.51% vs. 30.22%)，但選擇SBT的患者周期取消率高達78.61%，與文獻相符。這有可能是因為本研究中的Day 3胚胎均為非優質胚胎，不利于囊胚形成。有研究發現，卵裂胚的質量與囊胚形成率密切相關，當卵裂胚<7細胞、碎片比例>10%時，囊胚形成率及優質囊胚形成率顯著降低[14-15]。推測原因可能是細胞數少的胚胎發育潛能較低，而碎片使細胞體積減少，干擾了細胞間的連接與融合，抑制了囊胚腔的形成[16-18]。本研究中，選擇SBT的患者囊胚形成率僅為10.72%，說明這部分患者極有可能面臨無囊胚可用而取消周期的風險。在這種情況下，選擇繼續囊胚培養可能會加重患者的心理壓力，因此移植時期的選擇應更加慎重。

囊胚培養技術通過對胚胎發育潛能進一步篩選，獲得優質胚胎移植以提高臨床妊娠率。有研究證實部分Day 3非優質胚胎仍具有一定發育潛能，可以形成優質囊胚并最終獲得活產[19]。本研究中移植Ⅳ期囊胚患者的活產率達54.55%，與文獻結果一致，說明對于Day 3無優質胚胎的患者，進行囊胚培養后若能形成高質量囊胚，則可獲得較好的妊娠結局。但不可忽略的一點是非優質胚胎形成高質量囊胚的概率較低，本研究中選擇SBT方案的患者優質囊胚形成率僅0.82%，大部分患者移植囊胚均為早期囊胚(Ⅰ～Ⅱ期)。而隨著Day 5移植囊胚質量下降，患者臨床妊娠率和活產率也有下降趨勢，Ⅰ期囊胚移植組的臨床妊娠率(25.00% vs. 63.64%)和活產率(19.44% vs. 54.55%)顯著低于Ⅳ期囊胚移植組(P<0.05)，這與詹少泉等[20]的研究結果相符。可能因為Ⅰ期囊胚發育速度較慢，導致胚胎與子宮內膜不同步而種植失敗。

自然流產是臨床妊娠中主要的并發癥，ART中自然流產率約為10%～20%[21]。本研究結果表明，非優質胚胎患者SCT的流產率為17.65%，而SBT流產率為24.14%，略高于正常水平，這可能與移植囊胚的非整倍性有關[22]。Minasi等[23]研究發現，囊胚的整倍性與其擴張程度相關，與Ⅴ～Ⅵ期囊胚相比，Ⅰ～Ⅱ期囊胚為非整倍體的概率顯著提高(P=0.026)。考慮到本研究中大部分SBT周期移植的為Ⅰ～Ⅱ期囊胚，推測其中非整倍體囊胚比例較高，可能導致流產率增加。另外，延長體外培養時間，也可能會導致囊胚滋養層細胞的表觀遺傳學變化，增加基因表達錯誤概率[24-25]。同時，年齡也是流產率升高的影響因素之一[26]。本研究中，隨著年齡增長，患者的流產率有增高的趨勢。這可能是由于高齡患者子宮內膜容受性降低，胚胎染色體異常率較高，導致流產率增加[27]。因此，在Day 3將非優質胚胎植入母體，縮短體外培養時間，可能更有利于胚胎發育與種植。

綜上所述，對于Day 3均為非優質胚胎的患者，新鮮周期行單胚胎移植時，單囊胚移植與單卵裂期胚胎移植相比妊娠結局無明顯差異，但周期取消率顯著增加。因此，建議此類患者選擇Day 3單卵裂期胚胎移植，可能獲得更好的妊娠結局。本研究為單中心回顧性研究，樣本量較少，且不同中心對于非優質胚胎的定義不同，可能會影響結果，因此需進一步擴大樣本量開展多中心隨機對照研究來進一步研究論證。