選擇性單胚胎移植策略在凍融胚胎移植中的應用效果分析

陳曼，彭三鳳，林虹，李志凌

(汕頭大學醫學院第一附屬醫院，汕頭 515041)

隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技術的快速發展，胚胎種植率及臨床妊娠率顯著提高的同時，多胎妊娠也相應增多。由于移植多枚胚胎，IVF-ET妊娠的雙胎率遠高于自然妊娠，并且剖宮產、低出生體重、早產、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓疾病、子癇前期和子癇、難產和產后出血等產科并發癥的發生風險亦增加，且隨著孕婦年齡增大該增加趨勢越明顯[1]。IVF-ET治療的理想結局是獲得單胎、足月、健康的胎兒，盡量減少多胎妊娠風險及相關的產科并發癥，因此選擇性單胚胎移植(eSET)是實現此目標的有效措施。有研究表明，與雙胚胎移植(DET)相比，eSET足月單胎活產率更高[2]，而來自DET分娩的單胎發生不良圍產結局的可能性亦增加[3]。為了降低ART的多胎率，更好地保障母嬰安全，《關于胚胎移植數目的中國專家共識》[4]提出了eSET策略，但是部分生殖中心的多胎率仍高達30%以上。eSET對臨床妊娠率的影響是阻礙其大范圍推廣的原因之一。如何進一步細化eSET策略，在臨床妊娠率及多胎率之間維持平衡，是目前大多數生殖中心的重點和難點。本研究回顧性分析了eSET在凍融胚胎移植(FET)中的應用效果，以期為進一步推廣、細化eSET的臨床應用提供依據。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2020年1月至2021年12月在汕頭大學醫學院第一附屬醫院生殖醫學科行FET助孕治療的1 233個周期的臨床資料。納入標準：(1)年齡<40歲；(2)接受IVF或卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕治療，有凍存胚胎且胚胎成功解凍復蘇的患者；(3)囊胚移植均為單囊胚移植(SBT)周期，囊胚級別3BB及以上。排除標準：(1)年齡≥40歲；(2)移植胚胎數≥3枚；(3)序貫移植周期；(4)移植含多核、空泡、滑面內質網(SER)胚胎(含SER胚胎指SER聚集的卵母細胞形成的胚胎)的周期。

將納入研究對象根據移植次數不同分組：第1次移植為1次組，第2次移植為2次組，≥3次移植為多次組；根據患者年齡不同分為<33歲組、≥33歲組。各組內再根據移植胚胎類型、質量及數量細分為下列亞組：D5單囊胚移植組(SBT-D5組)，D6單囊胚移植組(SBT-D6組)，移植1枚D3優質胚胎組(SET-D3優組)，移植2枚D3優質胚胎組(DET-D3優組)，移植1枚D3優質胚胎+1枚D3非優質胚胎組(DET-D3組)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COS)及胚胎處理：根據患者基本情況選擇不同的COS方案，包括短效長方案、卵泡期長方案、拮抗劑方案和黃體期促排卵方案。根據取卵日男方精液情況進行常規IVF或ICSI，受精卵置于37℃、6%CO2培養箱中培養；取卵后第3天或第5天根據COS方案、卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發生風險、內膜情況等行胚胎移植或全胚冷凍。常規冷凍2～4枚卵裂期胚胎，優先冷凍優質胚胎，其余胚胎行囊胚培養。所有胚胎均采用玻璃化冷凍法，試劑盒及冷凍載桿購自日本加藤公司，具體操作按照說明書進行。

2.胚胎評價標準：(1)D3優胚標準：D1原核為2PN，D2細胞數為3～5細胞，D3細胞數為7～9細胞，D2發育至D3的細胞增速為3～5個細胞，D3胚胎評級為I級或Ⅱ級。(2)囊胚評級：按照Gardner提出的“囊胚擴張程度-內細胞團-滋養外胚層細胞”的評定模式[5]，進行囊胚期胚胎評分。

3.FET策略：根據患者情況采用自然周期、促排卵周期、激素替代周期或降調后激素替代周期進行內膜準備，冷凍胚胎復蘇后培養2 h行FET，并行常規黃體支持。(1)囊胚移植：所有囊胚移植均為單胚胎移植，移植的囊胚級別均為3BB及以上，優先選擇D5囊胚，其次為D6囊胚；在囊胚形成時間及級別相同的情況下，優先選擇D3為優胚的囊胚進行移植；(2)卵裂期胚胎移植：對沒有3BB及以上級別囊胚凍存的患者，選擇卵裂期胚胎復蘇移植。如年齡<33歲，首次移植優先選擇單優胚移植；如首次SET未孕，再次移植酌情予DET；如年齡≥33歲，首次移植予DET。對于子宮因素不宜雙胎妊娠者，如疤痕子宮、子宮畸形或矯形手術后、子宮頸機能不全或既往有雙胎妊娠及流產、早產等不良孕產史者；存在某些全身狀況不適宜雙胎妊娠者，例如：存在其他合并癥，身高<150 cm，體重<40 kg等；上述情況患者，如存在反復著床失敗、高齡、胚胎質量差等明顯影響成功率的因素，則在充分知情告知后謹慎進行DET，如雙胎妊娠建議減胎。

卵裂期胚胎移植后14 d(囊胚移植后12 d)測定血β-HCG，如β-HCG<50 U/L，停黃體支持藥物，監測β-HCG至陰性；如β-HCG≥50 U/L，確定為HCG陽性，繼續給予黃體支持；胚胎移植后4～5周行第1次B超檢查，記錄孕囊數、胎心搏動情況及胚胎著床部位。

4.主要觀察指標及判斷標準：比較各亞組間患者的平均年齡、不孕年限、轉化日內膜厚度、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率及早期流產率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；胚胎種植率=孕囊數/總移植胚胎數×100%；早期流產率=孕12周內自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；多胎率=多胎周期數/臨床妊娠周期數×100%。

超聲檢查可見孕囊或病理學檢查可見絨毛者為臨床妊娠；宮腔內同時有兩個或兩個以上胎兒為多胎妊娠；發生在妊娠12周以前的流產為早期流產；受精卵在子宮腔以外著床為異位妊娠。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況

本研究共納入1 233個FET周期，患者平均年齡為(31.16±3.77)歲(21～39歲)，平均不孕年限(3.92±2.48)年(1～14年)，平均移植次數(1.65±1.01)次，轉化日內膜厚度為(10.17±2.09)mm，移植胚胎數(1.22±0.42)枚，整體臨床妊娠率為60.02%，胚胎著床率為53.45%，多胎率9.59%，流產率11.89%，異位妊娠率1.89%。

二、不同移植次數各組中不同移植方案亞組的一般資料及妊娠結局比較

1.各組患者一般資料比較：1次組中SBT-D5組、SBT-D6組和SET-D3優組的平均年齡顯著低于DET-D3優組和DET-D3組(P<0.05)；各亞組間平均不孕年限及轉化日內膜厚度無顯著性差異(P>0.05)。2次組和多次組中各亞組間平均年齡、不孕年限及轉化日內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.各組患者妊娠結局比較：1次組中SBT-D5組的臨床妊娠率顯著高于SBT-D6、SET-D3優、DET-D3優組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于SET-D3優、DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產率顯著高于SBT-D5和DET-D3優組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)；2次組中SET-D3優組的臨床妊娠率顯著低于SBT-D5、SBT-D6及DET-D3優組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于其他3組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產率顯著高于SBT-D5組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)；多次組中SET-D3優、DET-D3組的臨床妊娠率顯著低于DET-D3優組(P<0.05)，DET-D3組的胚胎種植率顯著低于其他各組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產率顯著高于DET-D3優組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)(表2)。

表2 不同移植次數各組中不同移植方案亞組的妊娠結局比較(%)

三、不同年齡兩組中不同移植方案亞組的一般資料及妊娠結局比較

1.各組間一般資料比較：<33歲組中各亞組間平均年齡、不孕年限及轉化日內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)?！?3歲組中SET-D3優組的平均年齡顯著高于SBT-D5和SBT-D6組(P<0.05)，其余各亞組間不孕年限及轉化日內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

2.各組間妊娠結局比較：<33歲組中，SBT-D5組的臨床妊娠率顯著高于SBT-D6和SET-D3優組(P<0.05)，SBT-D5組的胚胎種植率顯著高于其余各組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產率顯著高于SBT-D5、DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)；≥33歲組中，SET-D3優組的臨床妊娠率顯著低于SBT-D5、SBT-D6、DET-D3優組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于其余3組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優、DET-D3組(P<0.05)(表4)。

表4 不同年齡兩組中不同移植方案亞組的妊娠結局比較(%)

討 論

本研究結果顯示，1次組中單胚胎移植組患者的平均年齡均顯著低于DET患者(P<0.05)，這與我院對年齡<33歲、首次移植患者優先實行eSET策略有關。另外，本研究≥33歲組中SET-D3優組的平均年齡顯著高于SBT-D5和SBT-D6組，這是由于隨著患者年齡增加、卵巢儲備功能下降，獲卵數和胚胎數都相應減少，為了減少囊胚培養失敗導致的無胚胎移植風險，我院常規冷凍2～4枚卵裂期胚胎，優先冷凍優質胚胎，剩余胚胎再行囊胚培養；而這可能導致部分高齡患者僅有凍存卵裂期胚胎，因此在進行FET時只能移植卵裂期胚胎。

eSET作為避免多胎妊娠的良好策略，面臨最大的問題是臨床妊娠率降低，如能進一步優化eSET策略，在臨床妊娠率及多胎率之間維持平衡，將有利于eSET的普及推廣。本研究納入的研究對象中，大部分采用單卵裂胚/囊胚移植，整體臨床妊娠率為60.02%，且多胎率低于10%。eSET的關鍵因素在于胚胎質量，選擇種植潛力好的胚胎可以縮短達到妊娠時間。目前，囊胚培養、時差監測培養系統(TLM)、胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)和代謝組學等多種胚胎優選的方法已逐漸應用于臨床[6]。但TLM系統價格昂貴，尚無法作為常規技術大規模使用；PGS因進行遺傳分析增加了時間及經濟成本，且部分胚胎無法培養至囊胚期進行活檢、活檢可能導致胚胎損害、醫源性非整倍體以及結果不準確等可能導致健康胚胎浪費等，影響了其作為常規篩查手段的應用[7]；代謝組學作為一個新興領域，其應用價值尚需進一步研究探索；只有囊胚培養僅僅通過延長胚胎培養時間進一步優選胚胎，因經濟成本低、實用性強而廣泛應用。但是，關于卵裂期胚胎或囊胚移植的利弊仍有爭議，一項Meta分析顯示囊胚較卵裂期胚胎在活產率、繼續妊娠率、臨床妊娠率、累積妊娠率和流產率等方面并沒有明顯優勢(低質量證據)[8]。與上述研究結果不同，本研究中不同移植次數組和不同年齡組囊胚移植的胚胎種植率顯著高于卵裂期胚胎或有增高的趨勢。郭曉曉等[9]的研究結果認為囊胚移植的臨床妊娠率顯著高于卵裂期胚胎移植；Zhu等[10]的研究亦發現單囊胚移植的活產率有高于單卵裂期胚胎移植的趨勢。但囊胚移植存在因延長培養時間導致周期取消率升高[11]、增加子代男女性別比[11-12]、增加早產及先天畸形的風險[13]，在臨床應用中也需引起重視。

在移植囊胚數目上，本研究中所有囊胚移植均為單囊胚移植。Freeman等[14]認為38歲以下人群采用單囊胚移植可在維持出生率的同時有效降低多胎率，這也為本研究中所有囊胚移植均實行單囊胚移植策略的可行性及有效性提供了佐證。囊胚根據形成時間不同分為D5和D6囊胚，不同發育天數的囊胚對臨床結局是否具有不良影響，目前尚無統一觀點。Ferreux等[15]發現移植D5囊胚的臨床妊娠率及活產率均顯著高于移植D6囊胚(P<0.05)。一項Meta分析結果也顯示，無論鮮胚或凍胚移植，D5囊胚較D6囊胚移植具有較高的臨床妊娠率和活產率[16]。漆倩榮等[17]則認為凍融周期胚胎的發育天數對妊娠結局無顯著影響。本研究結果顯示，首次移植和年齡在33歲以下的患者移植D5囊胚的臨床妊娠率及胚胎種植率均顯著高于移植D6囊胚及雙優質卵裂期胚胎(P<0.05)，但隨著移植次數的增多及年齡的增加，這種優勢逐漸減少。分析這可能與年輕患者、首次移植的D5囊胚多為剩余凍存胚胎的最優胚胎，胚胎整倍體率高有關。另外，本研究發現，在移植次數≤2次及年齡<33歲的患者中，D6囊胚移植的早期流產率均顯著高于D5囊胚(P<0.05)。該結果與之前文獻報道類似，Xu等[18]發現移植D6囊胚的早期流產率顯著高于D5囊胚(P<0.05)；還有研究顯示D6囊胚的整倍體率顯著低于D5囊胚(P<0.05)，推測與流產率升高有關，但具體機制仍有待進一步研究[19]。盡管本研究中移植次數≥3次及年齡≥33歲的患者中D5與D6囊胚移植的早期流產率差異無顯著性差異(P>0.05)，但D6囊胚的早期流產率仍有高于D5囊胚的趨勢，不排除與該亞組樣本量少有關，后續需要進一步開展大樣本的前瞻性研究加以驗證。

雖然雙卵裂期胚胎移植可達到類似單囊胚移植的活產率，但多活胎分娩率也隨之升高。臨床上有時期望通過移植1枚優胚+1枚非優胚的策略來實現維持臨床妊娠率、降低多胎率的目的，在本研究中，移植次數≤2次組及不同年齡分組中，DET-D3組的臨床妊娠率及多胎率均顯著高于SET-D3優組；在多次組中，DET-D3組的臨床妊娠率略低于SET-D3優組，多胎率顯著高于SET-D3優組。Zhu等[10]的研究亦認為，盡管單優胚移植的活產率顯著低于優+非優的雙胚胎移植，但后者的多活胎分娩率顯著增高，提示優+非優組合的雙胚胎移植并不能有效降低多胎風險。因單胚胎移植組剖宮產率、產前出血、早產、低出生體重、1分鐘Apgar評分<7分及新生兒住院率均低于雙胚胎移植組，因此Ma等[20]建議40歲以下患者，在有優質胚胎的情況下仍優先選擇單胚胎移植。如eSET失敗，再次eSET的臨床妊娠率、流產率及累積活產率與單周期DET后的臨床結局持平，同時有效降低了多胎妊娠率[21]。但是，在推行eSET的過程中，由于部分患者對雙胎的偏好甚至超過安全妊娠[22]，這部分患者會認為eSET是一次不必要且成本昂貴的嘗試，并且可能延遲其成功妊娠[23]，以及兩次eSET的成本并不低于DET[24]，這些因素都可能進一步阻礙eSET的推行。我院在eSET策略的探索中，經過2年的實踐證明，eSET可在維持臨床妊娠率的同時，明顯降低多胎率，因此認為eSET是切實可行的，值得進一步推廣應用。但本研究仍存在一定的局限性，首先，由于2021年大部分患者仍未分娩，活產率數據不全，故本研究未對活產率進行統計；其次，部分移植方案亞組間的年齡存在顯著性差異，可能會對妊娠結局的統計產生一定影響。后續需進一步完善研究設計加以探討。

綜上所述，對于40歲以內、首次行FET的患者，優先考慮移植1枚D5囊胚，其次為1枚D6囊胚；對于多次移植失敗的患者，可選擇雙優質卵裂期胚胎移植，但需警惕多胎的發生。