序貫移植改善高齡反復(fù)種植失敗患者的臨床結(jié)局

朱元昌，馬壯鴻，姜薇，譚芳，曾泳梅，鄧偉芬

(深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，深圳 518000)

隨著不孕不育的發(fā)生率逐年升高，輔助生殖技術(shù)(ART)成為不孕不育癥治療的重要手段。在過(guò)去的幾十年里，ART取得持續(xù)長(zhǎng)足的進(jìn)步，臨床成功率已提升至50%以上[1]，然而有部分患者即使經(jīng)過(guò)多次體外受精-胚胎移植(IVF-ET)仍未成功妊娠，在臨床上被稱(chēng)為反復(fù)種植失敗(RIF)。RIF通常是指≥2個(gè)新鮮或凍融周期，移植≥4枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或≥2枚優(yōu)質(zhì)囊胚而未獲得臨床妊娠的現(xiàn)象，在臨床中發(fā)生率為10%～15%[2-4]。RIF的發(fā)生會(huì)給患者帶來(lái)沉重的心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給臨床工作帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。

為了改善RIF患者的妊娠結(jié)局，近年來(lái)生殖領(lǐng)域?qū)W者一直在努力，并取得了一些不錯(cuò)的進(jìn)展，例如利用胚胎植入前非整倍體檢測(cè)(PGT-A)、子宮內(nèi)膜容受性基因表達(dá)譜檢測(cè)以及子宮內(nèi)膜微生態(tài)的檢測(cè)等，以排除由胚胎非整倍體[5]、子宮內(nèi)膜種植窗與胚胎發(fā)育不同步和內(nèi)膜菌群失調(diào)引起宮腔微環(huán)境改變而導(dǎo)致的種植失敗[6-7]。這些檢測(cè)方法和臨床手段在一定程度上能解決部分RIF患者的問(wèn)題，改善妊娠結(jié)局。但由于檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格、資質(zhì)及取樣對(duì)內(nèi)膜存在損傷等原因，無(wú)論是PGT-A、子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)還是內(nèi)膜微生態(tài)的檢測(cè)，在檢測(cè)的當(dāng)個(gè)周期均不能進(jìn)行新鮮周期移植，需推后移植時(shí)間，延長(zhǎng)了患者達(dá)到臨床妊娠的時(shí)長(zhǎng)。因此，尋找一種無(wú)創(chuàng)、價(jià)格合適、對(duì)中心資質(zhì)和設(shè)備要求不苛刻的方法十分重要，學(xué)者們一直在嘗試各種不同的方法，其中序貫移植是較為有應(yīng)用前景的一種。序貫移植通常是指在取卵后第3天(D3)給患者移植1枚卵裂期胚胎，在同一個(gè)周期的D5/D6給患者移植1枚囊胚的移植方法。有文獻(xiàn)報(bào)道，與常規(guī)的卵裂期或囊胚移植相比較，序貫移植能夠改善RIF患者的臨床妊娠結(jié)局[8]。本研究回顧性分析近兩年就診于我院的RIF患者，探討胚胎序貫移植對(duì)RIF患者臨床妊娠結(jié)局的改善作用，為序貫移植的推廣以及如何提高RIF患者的臨床妊娠的成功率提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析2020年1月1日至2021年8月31日在我院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET治療的RIF患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)的定義；(2)同一周期內(nèi)移植1枚D3卵裂期胚胎和1枚D5/D6的囊胚，或移植2枚D3卵裂期胚胎或D5/D6囊胚。

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在子宮畸形(單角子宮、鞍型子宮等)、子宮腺肌癥、疤痕子宮、宮腔粘連以及夫婦雙方或一方染色體異常者。

本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的122個(gè)移植周期。根據(jù)是否進(jìn)行序貫移植分成序貫組(57個(gè)周期，同一周期內(nèi)移植1枚D3卵裂期胚胎和1枚D5/D6的囊胚)和非序貫組(65個(gè)周期，同一周期內(nèi)移植2枚D3卵裂期胚胎或2枚D5/D6囊胚)。此外，根據(jù)傾向性匹配的原則，按照與序貫組1∶5的比例選取與RIF患者女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及抗苗勒管激素(AMH)水平相匹配的同期就診的非RIF患者作為對(duì)照組(移植2枚D3卵裂期胚胎或者移植2枚D5/D6囊胚)，共納入在本院行首次移植的對(duì)照組285個(gè)周期。

二、研究方法

1.控制性促排卵：入選周期控制性促排卵采用長(zhǎng)方案和拮抗劑方案為主，當(dāng)至少有2個(gè)卵泡直徑超過(guò)18 mm或者有3個(gè)卵泡直徑超過(guò)17 mm時(shí)給予肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000 U，36 h后在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道行取卵術(shù)。

2.精液處理和授精：女方患者取卵當(dāng)天丈夫采用手淫法取精。待精液完全液化后采用密度梯度離心15 min，離心力500g；洗滌后通過(guò)上游法獲得優(yōu)選精子，計(jì)算上游后精子的濃度和活力并置于培養(yǎng)箱中待用。授精的最終濃度(四孔板每孔中卵母細(xì)胞≤6枚)為1.0×105/ml。

3.短時(shí)受精與原核(PN)觀察：人工授精后置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，4～5 h后去除顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞極體(PB)個(gè)數(shù)；若極體數(shù)量為2，則顯示受精成功。第2天早上，即授精后16～18 h后觀察PN情況。若為2PN和2PB，表示正常受精；若為1PN，則為1PN受精；若為3個(gè)或以上PN，則為多原核受精。

4.胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的評(píng)價(jià)：根據(jù)卵裂球的細(xì)胞數(shù)目、大小、形態(tài)、碎片比例、空泡、多核、發(fā)育速度等綜合評(píng)估胚胎質(zhì)量。D3優(yōu)質(zhì)胚胎需要同時(shí)滿(mǎn)足以下條件：D1為2PN受精；D2胚胎細(xì)胞數(shù)為3～5個(gè)，綜合評(píng)級(jí)為I或Ⅱ級(jí)；D3細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)或融合狀，綜合評(píng)級(jí)為I或Ⅱ級(jí)。優(yōu)質(zhì)囊胚定義為：D1為2PN受精，D5/D6囊胚分期在3期及以上，滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分為A或B。序貫移植患者在D3移植1枚卵裂期胚胎，2～3 d后再次移植1枚D5/D6的囊胚；非序貫移植患者在D3移植2枚卵裂期胚胎或在D5/D6移植2枚囊胚。移植12 d后(囊胚移植10 d后)進(jìn)行尿試紙和血清HCG檢測(cè)，若血清HCG>25 U/L記為HCG陽(yáng)性；移植35 d后超聲檢查觀察到孕囊及原始心血管搏動(dòng)者記為臨床妊娠。根據(jù)孕囊個(gè)數(shù)及繼續(xù)妊娠情況統(tǒng)計(jì)臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率以及隨訪12周內(nèi)的早期流產(chǎn)率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組間基礎(chǔ)資料比較

序貫組、非序貫組及對(duì)照組間男女雙方的平均年齡、不孕年限、AMH水平、BMI以及原發(fā)不孕比例等基礎(chǔ)資料均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。序貫組和非序貫組平均移植次數(shù)及平均取卵次數(shù)較為接近(P>0.05)，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

二、各組間胚胎發(fā)育參數(shù)比較

各組間平均獲卵數(shù)、2PN受精率、多PN受精率、2PN卵裂率、D3優(yōu)胚率、可利用D3胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率以及優(yōu)質(zhì)囊胚率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、各組間臨床妊娠結(jié)局比較

與非序貫組相比，序貫組的臨床妊娠率及種植率有升高趨勢(shì)，多胎率及早期流產(chǎn)率有下降趨勢(shì)；但各組間移植胚胎數(shù)、HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

為了進(jìn)一步分析不同年齡段序貫移植的臨床結(jié)局，將納入研究對(duì)象按照不同年齡分為≤30歲、>30～<36歲、36～≤40歲、>40歲亞組，并進(jìn)行分層分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組間的基礎(chǔ)資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，數(shù)據(jù)未再贅述)。≤30歲、>30～<36歲、36～≤40歲的患者中，序貫組、非序貫組和對(duì)照組的HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、種植率及早期流產(chǎn)率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而>40歲的患者中，序貫組和對(duì)照組的HCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率和種植率顯著高于非序貫組(P<0.05)，早期流產(chǎn)率略低于非序貫組(P>0.05)；與對(duì)照組相比，序貫組的臨床妊娠率與種植率有升高的趨勢(shì)，流產(chǎn)率有下降的趨勢(shì)，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示序貫移植有利于改善高齡患者的臨床妊娠結(jié)局(表4)。

表4 不同年齡段各組間臨床妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

RIF是ART中常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是目前ART中的臨床難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)[9]。本研究數(shù)據(jù)顯示，序貫移植可以顯著改善年齡超過(guò)40歲RIF患者的臨床妊娠率以及胚胎種植率，這與Monteleone等[10]的報(bào)道類(lèi)似，提示在高齡RIF患者中通過(guò)序貫移植能夠改善臨床妊娠結(jié)局，這為RIF患者移植方案的選擇提供了參考與指導(dǎo)。

胚胎的成功種植依賴(lài)于高發(fā)育潛能的胚胎以及容受性良好的子宮內(nèi)膜，兩者缺一不可[11]。多次種植失敗的患者除了自身的胚胎因素外，有越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注到子宮內(nèi)膜容受性在胚胎種植失敗中扮演的作用。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是子宮內(nèi)膜是否能夠與“外來(lái)的”胚胎建立有效的“對(duì)話(huà)與應(yīng)答”以及“應(yīng)答”后能否順利接受種植前的胚胎[12]。有數(shù)據(jù)顯示，約25%的RIF患者是由于子宮內(nèi)膜的發(fā)育不同步導(dǎo)致的[13]。而序貫移植可能是解決子宮內(nèi)膜種植窗不同步的有效方法，主要原因是序貫移植是在同一周期內(nèi)先后分2次移植，通常是D3移植1枚卵裂期胚胎，D5/D6再移植1枚囊胚；第1次移植胚胎后對(duì)子宮內(nèi)膜造成了刺激，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜與胚胎的同步化發(fā)展，第2次移植時(shí)，子宮內(nèi)膜就能迅速識(shí)別胚胎，為胚胎的著床做好充分準(zhǔn)備，從而有效提高胚胎種植率以及臨床妊娠率[14]。

序貫移植不僅能改善胚胎著床的同步化問(wèn)題，同時(shí)在RIF患者的移植策略上也有相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。如果RIF患者移植兩枚D3卵裂期胚胎，仍不能獲得滿(mǎn)意的臨床妊娠結(jié)局，可能讓患者再次承受巨大的心理壓力；如果選擇囊胚移植，則需要所獲得胚胎全部養(yǎng)囊，尤其是當(dāng)患者D3可利用胚胎數(shù)目少、胚胎質(zhì)量較差的情況下可能無(wú)法形成可利用的囊胚；且即使患者條件好可以形成囊胚，移植2枚囊胚后多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。序貫移植較好地解決了這一難題，在改善臨床妊娠率的前提下還降低了多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究結(jié)果中3組間多胎妊娠率雖無(wú)顯著性差異，但序貫組的多胎妊娠率仍表現(xiàn)出低于其他兩組的趨勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示，序貫組與非序貫組兩組間的臨床妊娠率以及胚胎種植率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，提示序貫移植可能并不適用于所有的RIF人群。因此，本研究進(jìn)一步將研究人群按照年齡段進(jìn)行分層分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在年齡≤40歲的RIF患者中，序貫移植并沒(méi)有顯著改善RIF患者的臨床結(jié)局。但對(duì)年齡超過(guò)40歲的RIF患者，與非序貫組相比，序貫移植能夠顯著提高臨床妊娠率和胚胎種植率(P<0.05)；與對(duì)照組相比，序貫組的臨床妊娠率與種植率有升高的趨勢(shì)，且流產(chǎn)率有下降的趨勢(shì)(P>0.05)。其可能的原因是由于序貫移植能夠促進(jìn)母胎對(duì)話(huà)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的同步化發(fā)展，更有利于胚胎種植。有文獻(xiàn)報(bào)道，序貫移植不僅可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜與胚胎的同步性，還能改善子宮內(nèi)膜的容受性，從而提高胚胎種植率，改善臨床結(jié)局[16-17]。但由于本研究隨訪時(shí)間有限，部分患者尚未到活產(chǎn)時(shí)間，故未能對(duì)各組患者的活產(chǎn)率進(jìn)行比較，研究數(shù)據(jù)不夠全面，后續(xù)研究中應(yīng)該盡量完善。

綜上所述，序貫移植對(duì)于>40歲的高齡RIF患者來(lái)說(shuō)是一種有效的移植策略，其不僅可以改善子宮內(nèi)膜與胚胎種植的同步性，還能在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性，繼而改善妊娠結(jié)局；但該結(jié)論還需要以后大樣本的臨床研究加以驗(yàn)證。