利用去除透明帶的方法處理污染胚胎的可行性研究

古米娜·卡米力，區(qū)頌邦，杜鳳嬌，王文軍*，李瑞岐，*

(1.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，喀什 840000；2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院生殖內(nèi)分泌專科，廣州 510120)

細胞體外培養(yǎng)過程中發(fā)生微生物污染可以說自該技術發(fā)展以來就一直存在，胚胎體外培養(yǎng)自然也在其中，因此預防微生物污染是輔助生殖技術(ART) 實驗室的基本原則[1]。國內(nèi)有多個生殖中心對胚胎污染事件進行過報道[2-12]，這些研究中體外受精(IVF) 胚胎培養(yǎng)中污染發(fā)生率在0.04%～1.32%之間，平均污染發(fā)生率為0.27%，其中有1項研究報道了在ICSI周期發(fā)生污染的情況，發(fā)生率為0.02%[5]。國外學者報道的IVF周期污染發(fā)生率在0.18%～0.68%之間[13-17]，平均污染發(fā)生率為0.44%，ICSI周期污染發(fā)生率與國內(nèi)報道一致，為0.02%[16]。雖然發(fā)生比例比較低，但是一旦發(fā)生，危害性極大，往往導致患者無胚胎可用，進而整個周期被取消，對患者的經(jīng)濟和心里均會造成極大的損害。

在發(fā)生胚胎污染時，目前常用的方法是使用含抗生素的培養(yǎng)基充分洗滌，最大可能地去除胚胎表面的微生物[8-11]。雖然洗滌的方法在一定程度上可以挽救被污染的胚胎，但是由于胚胎透明帶的特殊結構[18]，往往很難將微生物徹底去除，多數(shù)情況下在洗滌后仍會有微生物的生長。那么在發(fā)生污染時，將胚胎的透明帶去除或者削薄是否可以挽救被污染的胚胎？目前尚未見有此類研究報道。本研究將對此問題進行探討，以期為處理被污染的胚胎提供更有效的處理措施。

資料與方法

一、研究對象

本研究中樣本來自中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院生殖中心，多精受精卵來自21例行IVF助孕患者的捐贈，患者年齡在24～40歲之間。

該研究獲得中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理審批(2022-KY-05)。

二、研究方法

1.胚胎感染過程：本實驗在獨立細胞培養(yǎng)室進行，使用獨立培養(yǎng)箱(APC-30D，ASTEC，日本)，實驗結束后對培養(yǎng)箱內(nèi)部進行消毒處理。多精受精卵各分3次收集，收集后的受精卵培養(yǎng)于G1-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，并在胚胎培養(yǎng)液滴中，靠近胚胎的部位加入約1 μl含菌培養(yǎng)液，共培養(yǎng)4 h。之后隨機分為對照組和實驗組兩組，并分別進行處理。大腸桿菌組共感染20枚多精受精卵，糞腸球菌組共感染24枚多精受精卵。

首次感染細菌來源于發(fā)生胚胎污染的胚胎培養(yǎng)液，之后的細菌來源于上次實驗后收集的含細菌培養(yǎng)液。

2.污染后處理：根據(jù)污染處理方案分為兩組。(1)對照組：采用常規(guī)培養(yǎng)液洗滌的方法，用平衡過的G1-plus培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中做5個約50 μl的液滴，將被污染的胚胎在每個液滴的不同位置反復吹洗，每過一個液滴更換一支新的巴氏吸管；洗滌后胚胎培養(yǎng)于平衡過的G1-plus培養(yǎng)液中。(2)實驗組：首先將被污染的胚胎用平衡過的G1-plus培養(yǎng)液吹洗3～5次，多個胚胎可一起吹洗，之后放于平衡過的G1-plus培養(yǎng)液中等待去除透明帶。去除透明帶時，用預熱至37℃的臺式酸在培養(yǎng)皿中做一個約20 μl的液滴，旁邊做3個20 μl的G1-plus培養(yǎng)液滴。將單個胚胎放入臺式酸液滴中(Tyrode’s Solution，T1788，Sigma，美國)，并用吸管單方向撥動胚胎，當觀察到透明帶開始消失時，立即將胚胎取出放于G1-plus培養(yǎng)液中，更換新的巴氏吸管后，快速在3個G1-plus培養(yǎng)液滴中輕柔吹洗，之后培養(yǎng)于G1-plus培養(yǎng)液中。每個胚胎依次按照上述方式進行處理。

3.胚胎培養(yǎng)：各組胚胎處理完畢后，受精卵(有個別已卵裂) 培養(yǎng)于G1-plus中。D3時將胚胎移入平衡過的G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)至D6。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6%CO2，飽和濕度。

4.觀察指標：觀察各組的胚胎再次污染率、D2胚胎卵裂率、D4胚胎融合率(含部分卵裂球融合) 以及囊胚形成率。

污染判定：培養(yǎng)液渾濁，20倍鏡下可見大量微生物。

三、統(tǒng)計方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析，采用3次實驗的總值(率)進行實驗組和對照組間的統(tǒng)計分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、污染模型

多精受精卵在經(jīng)過大腸桿菌或糞腸球菌污染培養(yǎng)液處理4 h后，在胚胎培養(yǎng)液滴中均出現(xiàn)大量細菌生長。

二、去透明帶對大腸桿菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

該部分研究分3批次進行，每次收集的多精受精卵數(shù)分別為7、7、6，具體分組如表1所示。經(jīng)相應污染處理措施后，對照組D2觀察到3批次胚胎均再次發(fā)生污染，D2卵裂率為80.00%(8/10)，胚胎在D3均全部發(fā)生退化，沒有進行囊胚培養(yǎng)；實驗組3批次均未發(fā)生再次污染，D2時胚胎全部發(fā)生卵裂，并在D3時全部進行囊胚培養(yǎng)，D4胚胎融合率為60.00%(6/10)，其中3個胚胎卵裂球完全融合、3個胚胎部分融合，其中1個胚胎未融合的卵裂球與融合部分發(fā)生分離(表1)。

表1 去透明帶對大腸桿菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

三、去透明帶對糞腸球菌污染胚胎的洗滌效果及發(fā)育的影響

利用同樣的方法，我們檢測了發(fā)生糞腸球菌污染時，去透明帶防止再次污染的效率以及對胚胎發(fā)育的影響。對照組共11枚受精卵，總污染率為81.82%(9/11)，總卵裂率為72.73%(8/11)，其中2枚沒有再次污染的胚胎行囊胚培養(yǎng)后，在D4時未形成桑椹胚，無囊胚形成；實驗組共14枚受精卵，總污染率為14.29%(2/14)，D3將未被污染的12枚胚胎進行囊胚培養(yǎng)后有6枚發(fā)生融合，融合率為50.00%(6/12)，其中2枚完全融合、4枚部分融合，沒有卵裂球游離現(xiàn)象發(fā)生，共有2枚囊胚形成，囊胚率為16.67%(表2)。

表2 去透明帶對糞腸球菌污染胚胎的的洗滌效果及發(fā)育的影響

討 論

在本研究中我們嘗試通過去除被污染胚胎透明帶的方法，阻止細菌對胚胎的再次污染。結果顯示，針對發(fā)生大腸桿菌和糞腸球菌污染的胚胎，去除透明帶能夠有效防止再次污染的發(fā)生，并且也能夠較好地維持胚胎的后續(xù)發(fā)育。Shu等[17]也嘗試了對被污染的胚胎進行去透明帶的方法，不過其報道中是將被污染的胚胎培養(yǎng)至囊胚，在凍融胚胎移植周期(FET) 將胚胎的透明帶全部去掉后進行移植，使2例患者獲得了妊娠，妊娠過程沒有發(fā)現(xiàn)不良反應。本研究與之區(qū)別是在污染發(fā)現(xiàn)時及時將透明帶去除，防止粘在透明帶上的細菌對胚胎造成再次污染，影響胚胎發(fā)育。

胚胎培養(yǎng)過程中發(fā)生微生物污染在ART中屬于較為嚴重的不良事件，會對胚胎的發(fā)育以及患者的利益產(chǎn)生較大影響，甚至產(chǎn)生醫(yī)療糾紛。在這些細菌污染中，50%以上都是由大腸桿菌引起的，其次還有糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌等，多數(shù)來源于精液[12，15]。真菌污染較為常見的是念珠菌，有研究顯示，念珠菌污染對胚胎的發(fā)育影響較小，胚胎可以進行移植[13，16]。而細菌污染發(fā)生后，其增殖代謝要消耗大量的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生多種有害的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及內(nèi)毒素等，會嚴重影響胚胎的發(fā)育，甚至影響胚胎染色體的整倍性[15]。有研究顯示，某些細菌在體內(nèi)共培養(yǎng)12 h后可導致小鼠卵母細胞DNA碎片化，提示這是影響卵母細胞和/或胚胎質(zhì)量的機制之一[19]。

李俐琳等[4]的報道顯示，多種污染微生物均可對胚胎產(chǎn)生致死效應，例如大腸桿菌、草綠色溶血鏈球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)吲哚黃桿菌、銅綠假單胞菌、腦膜膿毒性金黃桿菌等，有些是在受精過程中導致卵子死亡，有些是在培養(yǎng)過程中導致胚胎死亡。同一種細菌可以在不同的時間點對卵子或者胚胎造成死亡，這可能與細菌的亞型或者濃度有關。羅清炳等[7]報道了10個污染周期，其結果顯示，在受精過程中發(fā)生污染后，卵子的受精情況未受影響，但是胚胎的卵裂率和優(yōu)胚胎率均顯著降低，并且所有移植周期均未獲得妊娠。在聶睿等[9]報道的38例胚胎污染中，13例胚胎死亡或退化，3例胚胎發(fā)育停滯，2例胚胎發(fā)育遲緩，1例未卵裂。一些處理方法雖然可以挽救部分被污染的胚胎，但是多數(shù)情況下處理后的胚胎仍舊發(fā)生污染，最終無胚胎可用。我們以往的研究結果[2]顯示，在胚胎全部污染的42例中，有34例最終無可用胚胎；在移植的6例中，僅1例獲得妊娠。可見，污染發(fā)生后及時并有效的處理對胚胎的后續(xù)發(fā)育至關重要。

本研究提供了一種新的污染胚胎處理方法，并且可重復性較好，可以在保持胚胎發(fā)育潛能的前提下，有效避免再次污染的發(fā)生。但是本方法存在一定的局限性及可能的風險：第一，該方法處理后的胚胎需要進行囊胚培養(yǎng)，不適合卵裂期胚胎移植；第二，去除透明帶是在強酸溶液中進行，操作時間過長可能會損傷卵膜或者卵裂球胞質(zhì)膜，影響胚胎發(fā)育；第三，在胚胎早期將透明帶去除可能會導致胚胎在分裂過程中卵裂球間的接觸松散甚至分離。為了避免以上可能的風險，我們建議操作者盡量縮短胚胎在臺式酸中的作用時間，在操作時，觀察到透明帶出現(xiàn)變化后立即將胚胎吸出。另外，建議處理后的胚胎采用有獨立孔的time-lapse培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)或者采用懸滴(倒置) 培養(yǎng)，盡可能防止卵裂球的離散。

另外，在發(fā)生細菌污染時，用含其他抗生素的培養(yǎng)基進行處理也是去除污染源的一種方法。薛生娟等[10]報道了2例使用含0.15 mg/ml青、鏈霉素的HEPES培養(yǎng)液洗滌后成功挽救被大腸桿菌污染胚胎的案例。另外也有多項利用含慶大霉素培養(yǎng)基成功挽救被細菌污染胚胎的報道[8，11]。因此，我們推薦，在胚胎培養(yǎng)過程中發(fā)生細菌污染時，可先用含不同種類抗生素的培養(yǎng)基進行洗滌，在沒有效果后改用本方法做進一步處理。

綜上所述，胚胎培養(yǎng)過程中發(fā)生微生物污染后，去除胚胎透明帶可以高效阻斷污染的再次發(fā)生。鑒于微生物污染多發(fā)生于IVF周期，建議在原核觀察當天(D1)常規(guī)對IVF受精皿進行觀察，對可疑有細菌污染的受精皿，當天下午觀察胚胎培養(yǎng)皿是否確有細菌生長，以便早發(fā)現(xiàn)早處理，盡可能減少細菌對胚胎的不利影響，有利于胚胎的后續(xù)發(fā)育。